DNA重组技术的基本工具(上课用).ppt

专题专题1 基因工程基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基本工具：基本工具：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输分子运输车车”（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”来源：来源：主要从原核生物中分离纯化出来。主要从原核生物中分离纯化出来。种类：种类：已从近已从近300种微生物中分离出种微生物中分离出4000种限制酶。种限制酶。作用：作用：1.能识别双链能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键断开。磷酸二酯键：磷酸二酯键：具有特异性。具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割并且能在特定的切点上切割DNA分子，分子，作用特点：作用特点：大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成个核苷酸组成少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：EcoRI限制酶的切割：限制酶的切割：中轴线中轴线中轴线中轴线黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端在在在在GG与与与与A A之间切割之间切割之间切割之间切割 大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别只能识别GAATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开。之间切开。什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。补配对，这样的切口叫黏性末端。C C C G G GG G G C C C中轴线中轴线中轴线中轴线SmaI限制酶的切割：限制酶的切割：C C CG G GG G GC C C平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端只能识别只能识别CCCGGG序列，并在序列，并在C和和G之间切开。之间切开。产生黏性末端或平末端。产生黏性末端或平末端。限制酶的作用结果：限制酶的作用结果：你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原微生物的侵害。的防御机制，以防止外来病原微生物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，、使之失效，从而达到保护自身的目的。从而达到保护自身的目的。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性会产生相同的黏性(平平)末端，然后让两末端，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端黏合起来，就似乎可以合末端黏合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。思考思考?（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNA”DNA连接酶连接酶1 1、种类：、种类：Ecoli DNA Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA T4 DNA连接酶连接酶2 2、作用：、作用：可把黏性末端之间的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低相同点：相同点：形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键不同点：不同点：1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而DNA连连接酶是在两个接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键片段之间形成磷酸二酯键2）DNA聚合酶需要以一条聚合酶需要以一条DNA链为模板；链为模板；而而DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。不是一回事。不是一回事。类型：类型：类型类型类型类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接黏性末端只能连接黏性末端只能连接黏性末端只能连接黏性末端能连接黏性末端和能连接黏性末端和能连接黏性末端和能连接黏性末端和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。(三三)基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”载体的作用：载体的作用：质粒质粒 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物动植物病毒等动植物病毒等载体的种类：载体的种类：作为载体的必要条件：作为载体的必要条件：有切割位点有切割位点供外源供外源供外源供外源DNADNA片段片段片段片段(基因基因基因基因)插入。插入。插入。插入。能自我复制能自我复制有遗传标记基因有遗传标记基因供重组供重组供重组供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。载体载体DNA必需是安全的必需是安全的不会对受体细胞有害，或不会对受体细胞有害，或不会对受体细胞有害，或不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞不能进入到除受体细胞不能进入到除受体细胞不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。外的其他生物细胞中去。载体载体DNA分子大小应适合分子大小应适合以便提取和在体外进行以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。操作，太大就不便操作。质粒：质粒：裸露的、结构简单的、独立于细菌染裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复）之外，并具有自我复制能力的双链环状制能力的双链环状DNA分子。分子。质粒：质粒：能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别。培养基鉴别。培养基鉴别。培养基鉴别。1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）A、能复制、能复制 B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）有关基因工程的叙述中，正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体、质粒是基因工程中唯一的载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有多个、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接限制酶切点，以便与目的基因连接 D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键氢键C3.下列四条下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D答案：答案：D、关于限制酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基碱基序列序列B、EcoRI切割的是切割的是GA之间的氢键之间的氢键C限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNA分子，只分子，只切割外源切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中答案：答案：C.（多选）（多选）有关基因工程的叙述中，错误的有关基因工程的叙述中，错误的是是 A、基因工程技术能定向地改造生物的遗、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种传性状，培育生物新品种 B、重组、重组DNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体答案：答案：BD思考与探究思考与探究 P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基，或者通过甲基化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，的碱基上，使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的中含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被被切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。3、天然的、天然的DNA分子可以直接用做分子可以直接用做 基因工程载体吗？为什么？基因工程载体吗？为什么？提示：提示：提示：提示：基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核处染色体），即独立于细菌拟核处染色体），即独立于细菌拟核处染色体），即独立于细菌拟核处染色体DNADNA之之之之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNADNA分分分分子。子。子。子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：1 1）载体载体载体载体DNADNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2）载体载体载体载体DNADNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA的复制而同步复制。的复制而同步复制。的复制而同步复制。的复制而同步复制。3 3）载体载体载体载体DNADNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4 4）载体载体载体载体DNADNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5）载体载体载体载体DNADNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都连接酶都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链接单链DNA的酶。的酶。DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将单个核苷酸连只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)1)在两个在两个DNADNA片段之片段之间形成磷酸二酯键间形成磷酸二酯键2)2)以一条以一条DNADNA链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的两双链上的两个缺口同时连接起来，个缺口同时连接起来，不需要模板不需要模板 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基个碱基还是还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基上的碱基是反向、对称、重复排列的。是反向、对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？想一想限制酶所识别的序列有什么特点？