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第五章第五章 酶工程制药酶工程制药Enzyme Engineering for Enzyme Engineering for PharmaconPharmacon 1 1一、一、酶工程简介（酶工程简介（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering）酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程的名称出现在酶工程的名称出现在2020世纪世纪2020年代，主要指自然酶制剂在年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。工业上的规模应用。19531953年，年，GrubhogerGrubhoger 和和 SchleithSchleith 提出了酶固定化技术提出了酶固定化技术 。19691969年，日本人用固定化技术拆分了年，日本人用固定化技术拆分了DL-DL-氨基酸。氨基酸。19711971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。和固定化酶的应用。第一节第一节 概述概述2 2二、现代酶工程的主要内容二、现代酶工程的主要内容：a a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；开发；b b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；传感器、反应检测；c c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；研究；d d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e e、有机相中酶反应的研究；有机相中酶反应的研究；f f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g g、抗体酶、核酸酶的研究；抗体酶、核酸酶的研究；h h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。究。3 31 1、酶的来源、酶的来源：酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近1010年来，研究发展了动植物组织培年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：特点是：A A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到；年从微生物中得到；B B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；制培养条件来提高酶的产量；C C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。能培育出新的高产菌珠。第二节第二节 酶的来源和生产菌酶的来源和生产菌4 45 52 2、酶的生产菌、酶的生产菌（1 1）对菌种的要求：）对菌种的要求：a a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；生胞外酶的菌；b b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素；生毒素；c c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。（2 2）生产菌的来源：）生产菌的来源：a a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；菌种保藏机构和有关研究部门获得；b b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。6 6 筛选产酶菌的方法：筛选产酶菌的方法：采集菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。采集菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种菌种改良的途径：改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。（3 3）目前常用的产酶微生物）目前常用的产酶微生物 A A、E.coliE.coli ：是是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。B B、枯草杆菌：枯草杆菌：主要用于生产主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。酶、碱性磷酸脂酶。C C、啤酒酵母：啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。D D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。E E、其他产酶菌：其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。7 7一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备 1 1、固定化酶（、固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme）的定义的定义:指限制或固定于指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。2 2、固定化酶、固定化酶 的特点的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化8 8二、酶和细胞的固定化方法二、酶和细胞的固定化方法 1 1、载体结合法：、载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。定化方法。优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。降并污染产物。B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。不溶性载体上。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影的影响，离子强度高时，酶易脱落。响，离子强度高时，酶易脱落。9 9C、共价结合法：共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。2、交联法：、交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺苯胺-2-2、2-2-二磺酸、二磺酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基苯。二硝基苯。3、包埋法：、包埋法：（1）网格型：）网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。多用于固定化细胞。1010（2 2）、微囊型：）、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。但反应条件要求高，制备成本也高。4 4、选择性热变性法：、选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。的方法。此法专用于细胞固定化。三、酶和细胞的固定化载体三、酶和细胞的固定化载体 （1 1）吸附载体：）吸附载体：无机物和有机物无机物和有机物 （2 2）包埋载体：）包埋载体：卡拉胶、海藻胶卡拉胶、海藻胶 （3 3）共价结合载体：）共价结合载体：纤维素、纤维素、SephadexSephadex A200 A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。1111载体应具备的条件：载体应具备的条件：（1 1）固定化过程中不引起酶变性；）固定化过程中不引起酶变性；（2 2）对酸碱有一定的耐受性；）对酸碱有一定的耐受性；（3 3）有一定的机械强度；）有一定的机械强度；（4 4）有一定的亲水性和稳定性；）有一定的亲水性和稳定性；（5 5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；（6 6）共价结合时有可活化基团；）共价结合时有可活化基团；（7 7）有耐受酶和微生物细胞的能力：）有耐受酶和微生物细胞的能力：（8 8）廉价易得。）廉价易得。四、固定化酶的制备技术四、固定化酶的制备技术（1 1）吸附法制备技术：）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。1212（2 2）包埋法制备技术：）包埋法制备技术：凝胶包埋凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后加入要固定化的酶液，混合降至其凝固点以下的温度，然后加入要固定化的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。微囊化包埋微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约膜厚约20nm20nm，膜孔径膜孔径40 nm.40 nm.其表面积与体积比很大，包埋其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。酶量也多。（3 3）交联法制备技术）交联法制备技术：向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格状结构而形成固定化酶。反应速或酶分子间彼此连接成网格状结构而形成固定化酶。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、度与酶的浓度、试剂的浓度、pHpH、离子强度、温度和反应时离子强度、温度和反应时间有关。间有关。如：如：0.2%0.2%的木瓜蛋白酶和的木瓜蛋白酶和0.3%0.3%的戊二醛在的戊二醛在pH5.27.2pH5.27.2，0 0C C，24h24h即完成反应。即完成反应。1313五、固定化细胞的制备五、固定化细胞的制备 1 1、固定化细胞的定义、固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。细胞固定化技术是酶固定固定化酶同被称为固定化生物催化剂。细胞固定化技术是酶固定化技术的发展，因此固定化细胞也称第二代固定化酶。固定化细化技术的发展，因此固定化细胞也称第二代固定化酶。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。2 2、固定化细胞的特点、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化；）无需进行酶的分离纯化；（2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；（3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高；）细胞内酶比固定化酶的稳定性高；（4）细胞内酶的辅因子可以自动再生；）细胞内酶的辅因子可以自动再生；（5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。）抗污染能力强。14143 3、固定化细胞的制备技术、固定化细胞的制备技术 （1 1）载体结合法制备技术：）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点缺点：吸附容量小结合强度低。（2 2）包埋法制备技术）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。（3 3）交联法制备技术：）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。（4 4）无载体法制备技术：）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。1515六、固定化方法与载体的选择依据六、固定化方法与载体的选择依据 1 1、固定化方法的选择、固定化方法的选择 （1 1）固定化酶应用的安全性：）固定化酶应用的安全性：要按照药物和要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2 2）固定化酶在操作中的稳定性：）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本：）固定化的成本：包括酶、载体、试剂的包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。16162 2、载体的选择、载体的选择 为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。回收固定化酶。1717七、固定化酶的形状与性质七、固定化酶的形状与性质 1 1、固定化酶的形状、固定化酶的形状 （1 1）颗粒状：）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。母酶珠。（2 2）纤维状：）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。应器。1818（3 3）膜状固定化酶：）膜状固定化酶：可通过可通过共价结合共价结合的方法将的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4 4）管状固定化酶：）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。等酶管。19192 2、固定化酶的性质、固定化酶的性质 （1 1）酶活力的变化：）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。扩散阻力增大。（2 2）酶稳定性的变化：）酶稳定性的变化：包括对温度、包括对温度、pHpH、蛋白酶蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。度。2020A A、操作稳定性操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常是酶能否实际应用的关键因素。常用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即个月以上时，即具有工业应用价值。具有工业应用价值。B B、贮藏稳定性贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。C C、热稳定性热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。D D、对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空间位蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。2121（3 3）酶学特性的变化酶学特性的变化 A A、底物专一性：底物专一性：对底物的专一性下降。对底物的专一性下降。B B、最适最适pHpH：最适最适pHpH可能变大，也可能变小；可能变大，也可能变小；pH-pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。体的带电性质有关。C C、最适温度：最适温度：一般升高。原因是固定化后空一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。间结构更为稳定。D D、米氏常数米氏常数(Km)Km)：KmKm值均发生变化，有的增值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。加很小，有的增加很大，但不会变小。E E、最大反应速度最大反应速度（VmVm）：）：变化很小或不变。变化很小或不变。2222一、概述一、概述 药用酶在使用过程中往往存在酶的活力不高、药用酶在使用过程中往往存在酶的活力不高、稳定性较差、有抗原性等不足之处。因此必须对药稳定性较差、有抗原性等不足之处。因此必须对药用酶进行分子修饰，以提高酶的药用价值。用酶进行分子修饰，以提高酶的药用价值。1 1、概念：、概念：主要通过主链的切割、剪接和侧链基团主要通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，使酶分子结构的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的理化性质、某些特性发生某些改变，从而改变酶的理化性质、某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。和功能的过程，称为酶分子修饰。2 2、目的、目的（1 1）提高生物活性（包括对效应物生物）提高生物活性（包括对效应物生物性能的改变）；（性能的改变）；（2 2）培养在不良环境（非生理条件）培养在不良环境（非生理条件）中的稳定性；（中的稳定性；（3 3）针对异体反应，降低生物识别能）针对异体反应，降低生物识别能力。力。第四节第四节 药用酶的分子修饰药用酶的分子修饰23231 1、大分子结合修饰、大分子结合修饰 利用水溶性大分子（利用水溶性大分子（PEG、PVP-聚乙烯吡咯烷酮、PAA-聚丙烯酸、聚氨基酸、葡聚糖、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等）与酶共价结合，使酶的空间结构发生某些）与酶共价结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，使酶的特性和功能发生改变的方法称精细的改变，使酶的特性和功能发生改变的方法称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。主要是为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。主要是在酶分子表面形成覆盖层。在酶分子表面形成覆盖层。二、酶化学修饰方法二、酶化学修饰方法（一）酶的表面化学修饰（一）酶的表面化学修饰2424(1）通过修饰提高酶活力。水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可以使酶的空间构型发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶的活力得以提高。（2）通过修饰增加酶的稳定性。各种酶在保存或使用一段时间后，由于受各种因素的影响，原来完整的空间结构将会逐渐受到破坏，致使酶活力逐渐降低，最后完全丧失其催化功能。（3）通过修饰或消除抗原性利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶的抗原性的最有效方法之一。25254 4）肽链有限水解修饰）肽链有限水解修饰 酶蛋白的肽链经过部分水解，或失去活性；或仍维持酶蛋白的肽链经过部分水解，或失去活性；或仍维持其活性中心的完整构象，酶的活性仍可保持或失去不多；其活性中心的完整构象，酶的活性仍可保持或失去不多；或更有利于活性中心与底物的结合并形成准确的活化部位，或更有利于活性中心与底物的结合并形成准确的活化部位，酶显示出更强的催化功能。后两种情况下，肽链的水解在酶显示出更强的催化功能。后两种情况下，肽链的水解在限定的肽链上进行，成为有限水解。肽链的有限限定的肽链上进行，成为有限水解。肽链的有限 水解，使水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。功能的方法，称为肽链有限水解修饰。5 5）酶蛋白侧链基团修饰）酶蛋白侧链基团修饰 酶蛋白侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功酶蛋白侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能基团。酶蛋白侧链基团修饰一般采取化学方法，属于化能基团。酶蛋白侧链基团修饰一般采取化学方法，属于化学修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰学修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。有氨基修饰剂、羧基修饰剂、胍基修饰剂、巯基修饰剂。有氨基修饰剂、羧基修饰剂、胍基修饰剂、巯基修饰剂、酚基修饰剂、分子内交联剂等。剂、酚基修饰剂、分子内交联剂等。26262 2、小分子修饰、小分子修饰 利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。小分子化合物有：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻小分子化合物有：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸苯二酸酐、乙酸N N丁二酰亚胺酯。丁二酰亚胺酯。3 3、交联修饰、交联修饰 应用双功能基团试剂如戊二醛、应用双功能基团试剂如戊二醛、PEGPEG等将酶等将酶蛋白分子之间、亚基之间、分子内不同肽链部分之间蛋白分子之间、亚基之间、分子内不同肽链部分之间进行共价交联，使酶分子活性结构加固，提高其稳定进行共价交联，使酶分子活性结构加固，提高其稳定性，增加了酶分子在非水相中的使用价值。性，增加了酶分子在非水相中的使用价值。2727 若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸氨基酸置换修饰。置换修饰。通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增加酶的稳定性，更有通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增加酶的稳定性，更有利于酶的应用。利于酶的应用。氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用来修饰其他功能蛋氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。如：白质或多肽分子。如：-干扰素原来稳定性差，这是由于其分子中含有干扰素原来稳定性差，这是由于其分子中含有3 3个个半胱氨酸，其中两个半胱氨酸的巯基连接形成二硫键，而另一个半胱氨酸，其中两个半胱氨酸的巯基连接形成二硫键，而另一个Cys-17Cys-17的是的是的，当的，当-干扰素的游离巯基与另一个干扰素的游离巯基与另一个-干扰素的游离巯基相结合形成二硫干扰素的游离巯基相结合形成二硫键时，键时，-干扰素失去活性。若将该半胱氨酸用丝氨酸取代，就使干扰素失去活性。若将该半胱氨酸用丝氨酸取代，就使-干扰素干扰素不会形成二聚干扰素，从而大大提高其稳定性。不会形成二聚干扰素，从而大大提高其稳定性。氨基酸置换可以用化学方法进行。如用化学方法成功得将枯草芽孢杆菌氨基酸置换可以用化学方法进行。如用化学方法成功得将枯草芽孢杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸置换成半胱氨酸，经过修饰后，该酶对蛋白质和肽蛋白酶活性中心的丝氨酸置换成半胱氨酸，经过修饰后，该酶对蛋白质和肽的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学法的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学法氨基酸置换难度很大，受到诸多限制。氨基酸置换难度很大，受到诸多限制。-氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰28284 4、固定化修饰、固定化修饰 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶分子所处微环境的改变导致酶性惰性载体上，由于酶分子所处微环境的改变导致酶性质的（最适温度、质的（最适温度、pH、稳定性），特别是动力学发稳定性），特别是动力学发生改变。生改变。2929（二）酶分子内部修饰（二）酶分子内部修饰1 1、非催化活性基团的修饰、非催化活性基团的修饰 亲核残基（亲核残基（Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His）、）、亲电残基亲电残基（Tyr、Trp）、）、可氧化的（可氧化的（Tyr、Trp、Met）。）。对这类非催化对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。如将胰凝乳蛋白酶的能力。如将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，使该酶对芳香族氧化成亚砜，使该酶对芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的或大体积脂肪族取代基的专一性底物的Km提高提高2-3倍，而对非倍，而对非专一性底物的专一性底物的Km不变。不变。2 2、蛋白主链的修饰、蛋白主链的修饰 通过酶法将猪胰岛素变为人胰岛素：猪和人的胰岛素仅在通过酶法将猪胰岛素变为人胰岛素：猪和人的胰岛素仅在B链羧基端有一个氨基酸的差别，用蛋白水解酶将猪链羧基端有一个氨基酸的差别，用蛋白水解酶将猪B链末端的链末端的Ala水解下来接上水解下来接上Thr，就把猪的胰岛素变成人的胰岛素了。就把猪的胰岛素变成人的胰岛素了。30303 3、催化活性基团的修饰、催化活性基团的修饰采用化学突变的方法，将一种氨基酸侧链转变为另一种新的采用化学突变的方法，将一种氨基酸侧链转变为另一种新的氨基酸侧链。氨基酸侧链。4 4、与辅因子有关的修饰、与辅因子有关的修饰（1）对依赖辅因子的酶的化学修饰：）对依赖辅因子的酶的化学修饰：a、如果辅因子不以共如果辅因子不以共价结合，则可将辅因子共价结合到酶上；价结合，则可将辅因子共价结合到酶上；b、引入新的或修引入新的或修饰过具有强反应性的辅因子。饰过具有强反应性的辅因子。（2）将新的辅酶引入结构已经弄清楚的蛋白质上。）将新的辅酶引入结构已经弄清楚的蛋白质上。（3 3）金属离子置换修饰）金属离子置换修饰 有些酶含金属，而且往往是活性中心的组成部分。通过有些酶含金属，而且往往是活性中心的组成部分。通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，成为金属离子置换修饰，简称离子置换法。如方法，成为金属离子置换修饰，简称离子置换法。如-淀粉淀粉酶的酶的Ca2+,过氧化氢酶的过氧化氢酶的Fe2+等。等。31315 5、肽链伸展后的修饰、肽链伸展后的修饰 先用脲或盐酸胍处理酶，使酶分子的肽链充分延伸，提供先用脲或盐酸胍处理酶，使酶分子的肽链充分延伸，提供了化学修饰酶分子内部疏水基团的可能性。了化学修饰酶分子内部疏水基团的可能性。（三）结合位点突变的化学修饰（三）结合位点突变的化学修饰 通过一些可控制的方法在酶或蛋白质的特殊位点引入通过一些可控制的方法在酶或蛋白质的特殊位点引入特定分子来修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非氨特定分子来修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非氨基酸侧链来进行化学修饰，而得到一种新颖的酶制剂。利基酸侧链来进行化学修饰，而得到一种新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，再利用化学修饰法将突变的氨基酸进行修饰，引入一个小再利用化学修饰法将突变的氨基酸进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种化学修饰突变酶。分子化合物，得到一种化学修饰突变酶。3232三、修饰酶的特性三、修饰酶的特性1、热稳定性提高：共价连接使酶的天然构象产生一定的、热稳定性提高：共价连接使酶的天然构象产生一定的“刚刚性性”，并减少了酶分子内部基团的热振动，增加了热稳定性。，并减少了酶分子内部基团的热振动，增加了热稳定性。2、抗各类失活因子的能力提高：抗酸、碱、有机溶剂的能力、抗各类失活因子的能力提高：抗酸、碱、有机溶剂的能力提高。提高。3、抗原性消除、抗原性消除4、体内半衰期延长：修饰后增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂、体内半衰期延长：修饰后增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂5、最适、最适pH改变改变6、酶学性质变化：有些酶修饰后，、酶学性质变化：有些酶修饰后，Km值会变大。值会变大。7、对组织分布能力改变：能在血液中被靶器官选择性吸收。、对组织分布能力改变：能在血液中被靶器官选择性吸收。3333 蛋白质工程又称为第二代遗传工程：指通过改变与蛋白质蛋白质工程又称为第二代遗传工程：指通过改变与蛋白质相对应的基因的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到相对应的基因的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到宿主细胞，通过基因表达获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。宿主细胞，通过基因表达获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。蛋白质工程的主要步骤：蛋白质工程的主要步骤：（1 1）新蛋白质结构的设计：）新蛋白质结构的设计：根据已知的蛋白质或酶的化学结构、根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序，空间结构及其特性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序，确定欲置换的氨基酸及位置。确定欲置换的氨基酸及位置。（2 2）改变基因的核苷酸序列的确定：）改变基因的核苷酸序列的确定：根据欲得到的新的蛋白质根据欲得到的新的蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的的氨基酸序列，确定其对应的mRNAmRNA上的核苷酸序列，再根据互补原上的核苷酸序列，再根据互补原则，确定其对应的突变基因上的核苷酸序列。则，确定其对应的突变基因上的核苷酸序列。（3 3）突变基因的获得：）突变基因的获得：先用先用DNADNA合成仪合成寡聚核苷酸引物，通合成仪合成寡聚核苷酸引物，通过定点突变技术，获得所需的突变基因，称为寡聚核苷酸诱导的定过定点突变技术，获得所需的突变基因，称为寡聚核苷酸诱导的定位诱变，这是蛋白质工程中常见的技术。位诱变，这是蛋白质工程中常见的技术。（4 4）新蛋白质的产生：）新蛋白质的产生：将上述获得的突变基因插入到合适的基将上述获得的突变基因插入到合适的基因载体中，转化或转导到宿主细胞之中，在适宜的条件下进行表达，因载体中，转化或转导到宿主细胞之中，在适宜的条件下进行表达，产生出经过氨基酸置换的新的蛋白质或酶。产生出经过氨基酸置换的新的蛋白质或酶。四、蛋白质工程四、蛋白质工程3434 概念概念：通过物理方法，使酶分子的空间：通过物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。和功能的方法。物理方法不改变酶的组分或基团，酶分物理方法不改变酶的组分或基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是副键发生某子中的共价键不发生改