pcr技术发展概述.ppt
临床实验室中,PCR技术及其应用江苏大学 周滔提纲病毒性心肌炎的临床实例分析柯萨奇病毒的实验室检测方法引申,PCR技术,以及DNA测序六月,18区30床女病人主诉:上感(鼻塞,轻微咳嗽,无痰,无咽痛),乏力(需扶墙走,不能拿东西),头晕.体温38.5C体征:胸痛(瞬间痛)无胸闷,发痛前有牙龈肿痛两周,未见脓,未闻及心包摩擦音,奔马律.BP:92/62mmHg,P:92/min.六月30日入院时:2,3,aVF导联抬高0.2mV.CK 503U/L,CK-MB 56U/L.(当时未查Tro)7月2日:K 3.1(3.5-5.5)mmol/L,Tro 5.27(0-0.1)mmol/L,CK-MB 79.44(0.00-16.00)mmol/L,CK 1123.0(20-200)U/L,hs-CRP 11.53(0.0-3.00)mg/L.ECG:,aVF导联提示下壁ST段抬高;V4,5,6提示心尖导联抬高.好转以后T波倒置,异常Q波,有演变表现心超:收缩功能下降,室壁活动下降,无间断性,普遍的活动降低.病毒性心肌炎?急性心肌梗死?初步诊断甲强龙腎上腺皮质激素,下调免疫反应.(渐停)罗氏芬,抗感染.多巴胺,强心升血压VitC,VitB6,二磷酸果糖,营养心肌Kcl,Mgcl2采取措施实验室后继推荐检查病毒抗体效价滴定:Ab效价640?(320为可疑)ELISA 查柯萨奇病毒IgM,IgG.PCR作为临床科研常用的基因诊断方法,其扩增片段的特异性主要由引物决定,所以设计引物成为PCR成功的关键.在此,以柯萨奇病毒B3(CVB3)为例柯萨奇病毒B组3型GenBank:AY752944.2球形,衣壳20面体,核心为单正RNA病毒,有衣壳蛋白(VP)编码编码VP1VP1 tgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcaggaaaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctatagggagagttgcggat 2500 acagtccgataacttcctgtgaggaaagtaaagcgtccttttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccctctcaacgccta 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 accgtgggtacagggccaaccaactcagaagctataccagcactcactgctgctgagacaggtcacacgtcacaagtagtgccgggtgacaccatgcaga 2600 tggcacccatgtcccggttggttgagtcttcgatatggtcgtgagtgacgacgactctgtccagtgtgcagtgttcatcacggcccactgtggtacgtct 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 cacgccacgttaagaactaccattcaaggtccgagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggagtatgaaaactcagg 2700 gtgcggtgcaattcttgatggtaagttccaggctcagttggtatctcttgaaggatacatccagtcgtacgcacatgaaatgcctcatacttttgagtcc 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 tgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgacaagcagcacaacttaggagaaagctagaattctttacctacgtccggttcgacctggagctg 2800 acggttcgccatacgacttacccataattgtggtgctgttcgtcgtgttgaatcctctttcgatcttaagaaatggatgcaggccaagctggacctcgac 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 acgtttgtcataacaagtactcaacagccctcaaccacacagaaccaagacgcacagatcctaacacaccaaattatgtatgtaccaccaggtggacctg TaqII|taccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatctacgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgccccgccgcgcatgtccataccgttttt 3000 atggtctatttcaactaagtatgcacaccgtttgtagatgcttagggtcacacaaaacctggctccctttgcggggcggcgcgtacaggtatggcaaaaa 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 AhdI PfoI|gagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaattttccaggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgcta 3100 ctcgtaaccgttgcggataagtttaaagatactgcctaccagacttaaaaggtccttgcctcaaatgccgtagttgtgcgatttgttgtacccgtgcgat 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 tatgcaagacatgtcaacgctggaagcacgggtccaataaaaagcaccattagaatctacttcaaaccgaagcatgtcaaagcgtggatacctagaccac 3200 atacgttctgtacagttgcgaccttcgtgcccaggttatttttcgtggtaatcttagatgaagtttggcttcgtacagtttcgcacctatggatctggtg 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 ctagactctgccaatacgagaaggcaaagaacgtgaacttccaacccagcggagttaccactactaggcaaagcatcactacaatgacaaatacgggcgc 3300 gatctgagacggttatgctcttccgtttcttgcacttgaaggttgggtcgcctcaatggtgatgatccgtttcgtagtgatgttactgtttatgcccgcg 3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 atttggacaacaatcaggggcagcgtatgtggggaactacagggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtgggaaagt 3400 taaacctgttgttagtccccgtcgcatacaccccttgatgtcccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccctttca 3310 3320 3330 3340 3350 3360 3370 3380 3390.aaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctataggga.K L F P G P S G R R D N S R Y R E N F F Q G P V E D A I T A A I G R T F S R A Q W K T R *Q P L *G .tttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccct.5-.ggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtggga.G S K *T S S Y Q C *L A K L C V G V V N R H L A T S A D W Q N C V W E *I D I *L P V L T G K T V C G K.ccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccct.3-5-3-CVB3 VP1基因序列G+C=13,A+TG+C=13,A+T=7=7 Tm=(52+14)-Tm=(52+14)-5=615=61G+C=12,A+T=8G+C=12,A+T=8Tm=(48+16)-Tm=(48+16)-5=595=59keynote一般引物长度为1830碱基GC含量,在4060%左右退火温度引物自身不应有发卡结构决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于20bp时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小引物3端是延伸开始的地方,所以不可以有连续的gggccc的序列keynote扩增基因片段要大于1个ORF,常选择150bp以上Forward Primer length:20bpGC含量13/20=65%Tm initial/Tm final:34./64.6Reverse Primer length:20bpGC含量:12/20=60%Tm initial/Tm final:34./60.5总结PCR扩增目的基因片段,关键在于一对引物的设计,而引物的设计要同时满足多个条件,尤其是当目的片段基因GC/AT含量明显有倾向时,就要在倾向一侧加A,T或者GC,来达到合适的GC含量,但是又不能有发卡结构,又要保证特异性扩增的片段要进行检测,可以跑条带,和marker做比对,但是往往后续实验常用限制性内切酶继续修饰两端,达到和其他基因或者质粒连接的目的非编码区的数量与生物进化程度有密切关系，在微生物中，非编码区只占整个基因组序列的10%20；但在高等生物和人类基因组中，非编码序列则占了基因组序列的绝大部分。在非编码区还存在大量的重复DNA序列，这些DNA看似没有意义也不能编码蛋白质，却能形成特殊的DNA高级结构，并以此调节附近基因的活性。对非编码区的一个主要研究方向是对调控元件的研究。因为在非编码区，只有一小部分已被证实为有用成分，能帮助基因开启和关闭以调控基因的表达，即调控DNA,也称为启动子。序列捕获芯片技术用微乳滴PCR(emulsion PCR,emPCR)来生成扩增产物.将固化引物的微球与单链DNA文库模板以及必要的PCR反应化合物一起混合,微球与文库片段的比例适当,以确保大多数微球结合的单链DNA分子不超过一个.水溶液与油混合形成油包水结构乳滴.每个乳滴都是一个进行后续PCR反应的微型化学反应器.经过多轮热循环,每个微球表面都结合了数千个相同的DNA拷贝.然后打破微乳滴后,扩增微球被收集、富集并固定在一个平的玻璃基板上形成一个无规则的阵列.转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上.每个微孔只能容纳一个微球.微孔板被安装成为流通池的一部分.其中一面可以通过测序反应的化合物,另一面则与CCD光学检测系统的光纤部件相接触.测序技术1,杂交测序 第一代的sanger法,测量耗时耗力,片段短.2,合成测序 Solexa,Roche 454(焦磷酸法)3,单分子测序 生物纳米孔,非光学显微镜直接碱基成像 Solexa测序基于PCR原理的扩增技术有了很大的发展.针对不同的实验标本对象及需求,要选择适合的技术方法.高效,高质量,低成本,这三者间要找到合适的平衡点.总结
