课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3).ppt

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用【课题目目标】研究培养基研究培养基对微生物的微生物的选择作用，作用，进行微生行微生物数量的物数量的测定。定。【研究研究对象象】土壤中能分解尿素的土壤中能分解尿素的细菌菌【达到目的达到目的】（1）从土壤中分离出能）从土壤中分离出能够分解尿素的分解尿素的细菌菌（2）统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有多少品中究竟含有多少这样的的细菌菌一、研究思路一、研究思路1、PCR技术及提示技术及提示2、实验室微生物的筛选原理（、实验室微生物的筛选原理（P21）3、选择培养基（阅读配方）、选择培养基（阅读配方）（一一）筛筛 选选 菌菌 株株人人为提供有利于目的菌株生提供有利于目的菌株生长的条件（包括的条件（包括营养、养、温度、温度、pH等），同等），同时抑制或阻止其他微生物生抑制或阻止其他微生物生长。在微生物学中，将允在微生物学中，将允许特定种特定种类的微生物生的微生物生长，同同时抑制或阻止其他种抑制或阻止其他种类微生物生微生物生长的培养基，称的培养基，称做做选择培养基培养基。寻找目的菌株找目的菌株时，要根据它，要根据它对生存生存环境的要求，境的要求，到相到相应的的环境中去境中去寻找找能分解尿素的细菌的筛选能分解尿素的细菌的筛选 阅读教材教材22页第一大段相关内容，并思考回答下列第一大段相关内容，并思考回答下列问题：1.在培养基的配方中，在培养基的配方中，为微生物的生微生物的生长提供碳源提供碳源和氮源的分和氮源的分别是是什么物是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素。碳源是葡萄糖，氮源是尿素。2.分析分析该配方的培养基配方的培养基对微生物是否具有微生物是否具有筛选作作用？如果有，又是如何用？如果有，又是如何进行行筛选的？的？有有筛选作用。作用。尿素是培养基中的尿素是培养基中的唯一氮源唯一氮源，因此，原，因此，原则上只有则上只有能够利用尿素能够利用尿素的微生物才能够生长。的微生物才能够生长。答：不一定，答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。需要进一步的验证。3.3.只要能够在选择培养基上生长的微生物是只要能够在选择培养基上生长的微生物是否就是所需要的微生物？否就是所需要的微生物？统计菌落数目的理论依据是：统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将确，通常将几个稀释度几个稀释度下的菌液都涂布在下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在平板上，培养后再选择菌落数在3030300300的平板进行计数。的平板进行计数。（二二）统计菌落数目统计菌落数目 1.1.想一想，如何从平板上的菌落想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计的菌落数，最好能统计3 3个平板，计个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。课本旁栏的公式进行计算。实例分析实例分析第一位同学只涂布了一个平板，没有第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中涂布了三个平板，但是其中1个平板的个平板的计数结果与计数结果与2个相差太远，说明在操作个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将单地将3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。实例启示实例启示1、在实验设计时，一定要涂布至少、在实验设计时，一定要涂布至少3个平个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。准确性。2、在分析实验结果时，一定要考虑所设、在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。意味着操作有误，需要重新实验。微生物数量微生物数量计数方法数方法1、稀、稀释涂布平板法涂布平板法间接接计数方法数方法（注：菌落数往往比活菌数（注：菌落数往往比活菌数 ）2、显微微镜计数法数法直接直接计数法数法低低当两个或多个当两个或多个细胞胞连在一起在一起时，平板上平板上观察到的是一个菌落。察到的是一个菌落。（三）设置对照（资料分析）（三）设置对照（资料分析）1、设置置对照的目的照的目的2、对照照实验概念概念排除排除实验组中非中非测试因素因素对实验结果的果的影响，提高影响，提高实验结果的可信度。果的可信度。对照照实验是指除了被是指除了被测试的条件以外，的条件以外，其他条件都相同的其他条件都相同的实验。A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。另一种方案另一种方案：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。实验方案有两种实验方案有两种一种方案一种方案：可以由其他同学用与可以由其他同学用与A A同学一样的土样进行实同学一样的土样进行实验，如果结果与验，如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；如果结无误；如果结果不同，则证明果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的配同学存在操作失误或培养基的配制有问题。制有问题。通过这个事例可以看出，实验结果要有说通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的服力，对照的设置是必不可少的四、实验设计四、实验设计实验的具体操作步骤如下实验的具体操作步骤如下:资料资料一一.土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。实验名称实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（实验案例（实验案例）在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为培养基可以作为对照对照，用来判断选择培养基是否，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。起到了选择作用。制备培养基：制备培养基：准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。将将10 g10 g土样加入盛有土样加入盛有90 mL90 mL无菌生理盐水无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1 mL1 mL，转，转移至盛有移至盛有9 mL9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至次等比稀释至10107 7稀释度，并按照由稀释度，并按照由10107 710103 3稀稀释度的顺序分别吸取释度的顺序分别吸取0.1 mL0.1 mL进行进行平板涂布操作平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移不必更换移液管液管。资料资料 二二.样品的稀释样品的稀释由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性好氧及兼性厌氧细菌厌氧细菌数约为数约为2 1852 185万，万，放线菌数放线菌数约为约为477477万，万，霉菌数霉菌数约为约为23.123.1万。因此，为获得不同类型的微万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。当有针对性地提供选择培养的条件。将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30 30 温度下培养。温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚酚红红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-102-10的颜色反应。如果有则说明该的颜色反应。如果有则说明该选择培养选择培养基中基中确实含有确实含有能分解尿素的细菌。能分解尿素的细菌。资料三资料三.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 5.5.细菌的计数细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数当菌落数目稳定时，选取菌落数在在3030300300的平板进行计数。在同一的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。目。五、操作提示五、操作提示无菌操作无菌操作做好标记做好标记规划时间规划时间六、课题成果与评价六、课题成果与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目培养基的数目，说明选择培养基已筛选，说明选择培养基已筛选出一些菌落。出一些菌落。如果学生选取的是同一种土样，统计的结如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否成功（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致2提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。课后练习课后练习P26伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的为的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并带有金属光泽深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。制其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基例如：鉴别大肠杆菌培养基大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征本课题知识小结本课题知识小结:1.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时A、葡萄糖在培养基中越多越好、葡萄糖在培养基中越多越好 B、尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮C、尿素在培养基中越少越好、尿素在培养基中越少越好 D、尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素、尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮为化合态氮多思多得！多思多得！2.下列属于菌落特征的是（下列属于菌落特征的是（）菌落的形状菌落的形状 菌落的大小菌落的大小 菌落的多菌落的多少少 隆起程度隆起程度 颜色颜色 有无荚膜有无荚膜A.B.C.D.