《单克隆抗体制备》PPT课件.ppt

单克隆抗体制备单克隆抗体制备Monoclonal antibody 单个单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗抗原决定簇的抗体。分三个阶段：原决定簇的抗体。分三个阶段：（1）免疫）免疫Balb/c小鼠小鼠（2）建立筛选方法和程序）建立筛选方法和程序（3）杂交瘤的生成）杂交瘤的生成一、动物免疫一、动物免疫1 Balb/c小鼠小鼠6-8周龄，周龄，25g左右，雌性较佳左右，雌性较佳2 免疫方法免疫方法（1）首次腹腔免疫）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂抗原与福氏完全佐剂 1：1的混和液，一般的混和液，一般2-3只鼠只鼠（2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂天后加强免疫，用福氏不完全佐剂（3）15天后，尾静脉注射天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体 程序依抗原性质而定。程序依抗原性质而定。可溶性蛋白（提取或表达的蛋白）可溶性蛋白（提取或表达的蛋白）50-100g颗粒性蛋白（病毒）颗粒性蛋白（病毒）50-100g细菌细菌 106CFU活细胞活细胞（哺乳动物细胞）（哺乳动物细胞）105-7CFU活癌源细胞活癌源细胞 104-6CFU糖类（多糖、糖蛋白）糖类（多糖、糖蛋白）100-200g核酸核酸 100-200g1 在液氮罐中取保存的在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以细胞，以 MEM培养基复苏，培养基复苏，37 CO2 培养箱中培养培养箱中培养2 在对数生长期收获在对数生长期收获107-108CFU的的 SP2/0细胞细胞3 500 g离心离心5min，弃上清，弃上清4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20 mL MEM营养液中营养液中二、骨髓瘤细胞的培养二、骨髓瘤细胞的培养注意要点：注意要点：1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否检测是否 有支原体污染有支原体污染2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免长期培养长期培养3 融合的细胞要处于对数生长期融合的细胞要处于对数生长期三、饲养细胞的制备三、饲养细胞的制备1 取清洁级取清洁级ICR小鼠小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 将小鼠四肢固定，腹部朝上将小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤4 用用20mL注射器吸取注射器吸取15mLMEM营养液，注入营养液，注入小鼠腹腔小鼠腹腔5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次，次，将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用瓶内待用6 将饲养细胞转至将饲养细胞转至50mL离心管内，离心管内，500g离心离心 5min，以，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用养瓶内待用注意事项：注意事项：1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否 则会造成污染则会造成污染3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的 位置，重新吸取细胞液位置，重新吸取细胞液四、脾细胞的制备四、脾细胞的制备1 取取Balb/c小鼠小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 将小鼠四肢固定，腹部朝上将小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔4 小心分离出脾脏，置含有小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培营养液的培 养皿内养皿内5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来细胞分离出来6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离离 心管中，沉降心管中，沉降5min7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心离心 5min，弃上清，沉淀以，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬培养基重悬注意事项：注意事项：1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心，取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心，不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，应选用备用小鼠的脾脏应选用备用小鼠的脾脏五、细胞融合及培养五、细胞融合及培养1 以以2：1混合脾脏细胞和混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细细胞，加至细 胞融合管中胞融合管中2 在室温下在室温下500g离心离心10min，弃上清，弃上清3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置 37水浴水浴4 在在60S内用巴氏吸管将内用巴氏吸管将0.8mL预热至预热至37 PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次5 在在90S内，用移液管轻轻将内，用移液管轻轻将30mL预热至预热至37的的MEM培养基加至融合管中培养基加至融合管中637水浴水浴5min7室温下室温下500g离心离心10min，弃上清弃上清8在融合管内加入在融合管内加入HAT培养基培养基20mL，将沉将沉淀悬浮，后移置淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加的玻璃瓶中，并加入入HAT培养基培养基30mL，后加入后加入10-15mL饲饲养细胞悬液养细胞悬液9 将细胞悬液加至将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔孔细胞培养板中，每孔2-mL10 将细胞培养板置将细胞培养板置37 饱和湿度的饱和湿度的CO2 培养培养 箱中培养箱中培养11 培养培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况察细胞融合情况12 培养置第培养置第5天时用天时用HAT培养基换液，换培养基换液，换1/213 7-8天用天用HT培养基换液，全部换液培养基换液，全部换液14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，以上，细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。的抗体。注意事项：注意事项：1 脾脏细胞与脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在细胞的比例在2：1 5：1最好最好2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打细胞融合是关键步骤，避免用力吸打3 细胞融合后细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括天要注意检查是否污染，包括 细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸出或冲散出或冲散六、杂交瘤细胞的筛选六、杂交瘤细胞的筛选 大约有大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而的杂交瘤细胞能分泌抗体，而分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中间接等。其中间接ELISA应用最广。应用最广。注意事项：注意事项：1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗的抗体。如体。如 单用酶标记抗单用酶标记抗IgG抗体，则抗体，则IgM类单抗类单抗就不能被筛选出来。就不能被筛选出来。2 阳性克隆转移到阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次满后，上清再检测一次3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法最好特异单抗的方法最好七、杂交瘤细胞克隆七、杂交瘤细胞克隆 在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂交瘤经过交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。次克隆后就稳定了。1 在克隆的前一天，准备数块含有在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲饲养细胞的养细胞的96孔板孔板2 将将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL细胞悬液加入细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀台盼蓝染色液，混匀3 血液计数板计数血液计数板计数4 在在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释倍比稀释5 当稀释至当稀释至100CFU/mL时，取时，取1mL细胞悬液至细胞悬液至装有装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至培养基的瓶中，再分别加至96孔板孔板中（预先加有饲养细胞），中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔孔6将细胞培养板置将细胞培养板置37 饱和湿度的饱和湿度的CO2 培养箱中培养箱中培养培养10天左右，注意观察天左右，注意观察7 大约大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7天换液一次，天换液一次，8 10天左右克隆长满，可以检测上清天左右克隆长满，可以检测上清注意事项：注意事项：1 上清液要在上清液要在24 h内测定内测定2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞为深蓝色，且没有光泽为深蓝色，且没有光泽3 如有高质量的如有高质量的FCS，可不用饲养细胞，可不用饲养细胞4 一个克隆需亚克隆一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定次，才稳定5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加1mol/mL的的Cu SO4溶液溶液七、实验室规模抗体制备七、实验室规模抗体制备体外上清液培养体外上清液培养1 杂交瘤细胞先在杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养的细胞培养瓶中培养2 细胞长满瓶底后转至细胞长满瓶底后转至50或或100mL的细胞培的细胞培养瓶中培养养瓶中培养3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的培养液，并重复收集上清培养液，并重复收集上清2次次4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上清清体内生产腹水体内生产腹水1 正常培养杂交瘤细胞正常培养杂交瘤细胞2 饲养饲养Balb/c小鼠，注射细胞一周前通过腹腔小鼠，注射细胞一周前通过腹腔注射注射0.5mL降植烷降植烷3 在细胞对数生长期收获细胞，并进行计数，在细胞对数生长期收获细胞，并进行计数，将细胞数量以培养液调整至（将细胞数量以培养液调整至（2-10）107CFU4 小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，细胞悬液，1-2周后发周后发展成癌性腹水展成癌性腹水5 用注射器收集腹水，用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠天收集一次，每只鼠 可收集可收集2-3次次6 腹水腹水5000g离心离心10min，收集澄清的上清，收集澄清的上清，除去油脂除去油脂7 加入加入0.05%的叠氮钠，小量分装保存。长期的叠氮钠，小量分装保存。长期 置置-70保存；备用保存；备用4 保存保存八、杂交瘤细胞的保存八、杂交瘤细胞的保存1 培养杂交瘤细胞至对数生长期培养杂交瘤细胞至对数生长期2 弃去细胞培养上清，以弃去细胞培养上清，以Hanks液洗涤一次液洗涤一次3 弃去洗涤液，加入含弃去洗涤液，加入含10%DMSO、10%犊犊 牛血清的牛血清的MEM培养基，吹打细胞培养基，吹打细胞4 将细胞悬液加入细胞冻存管，每中等细胞培将细胞悬液加入细胞冻存管，每中等细胞培 养瓶分两管，先放养瓶分两管，先放-70冰箱冻冰箱冻30min，然后，然后置液氮罐中保存置液氮罐中保存