生物药物制备技术.ppt

生物药物的制备技术第一节第一节 蛋白质类药物的工业生产蛋白质类药物的工业生产一、材料的选取来源：动植物组织、微生物等。来源：动植物组织、微生物等。选取原则：富含蛋白质、容易获得和提取、无害选取原则：富含蛋白质、容易获得和提取、无害二、蛋白质的提取胞外蛋白质胞外蛋白质溶媒提取溶媒提取胞内蛋白质胞内蛋白质破碎细胞破碎细胞溶媒提取溶媒提取超声波、匀浆器等超声波、匀浆器等三、蛋白质的分离纯化最常用方法最常用方法常用常用NaClNaCl、硫酸铵等硫酸铵等盐析法盐析法 加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。蛋白质一般不变性。有机溶剂有机溶剂沉淀法沉淀法常用常用乙醇、丙酮乙醇、丙酮 易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。可用于混合蛋白质的分级沉淀。等电点等电点沉淀法沉淀法选择在选择在pIpI不不变性的蛋白质变性的蛋白质 常联合其它方法使用。根据溶解度分离根据分子大小和形状分离半透膜常用玻璃纸等透析法透析法 加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。大分子不大分子不可透过半透可透过半透膜。膜。超滤法超滤法超滤膜不同孔径膜 易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。大分子截大分子截留小分子滤留小分子滤过。过。凝胶凝胶过滤法过滤法分子筛凝胶葡聚糖凝胶等 常联合其它方法使用。大分子受阻大分子受阻小，小分子小，小分子受阻大。受阻大。DialysisDialysis透析法透析法凝胶过滤法凝胶过滤法Gel-Filtration ChromatographyGel-Filtration Chromatography根据电离性质分离蛋白质所带电荷蛋白质所带电荷种类、数量及种类、数量及分子大小差异分子大小差异电泳法电泳法 蛋白质分离和分析的常用方法。醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。离子交换离子交换层析法层析法不同蛋白质与不同蛋白质与离子交换剂结离子交换剂结合力大小不同合力大小不同 可通过改变溶液pH和盐离子强度分离蛋白质。离子交换纤维素、离子交换凝胶、大孔离子交换树脂等。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Polyacrylamide Gel Electrophoresis等电聚焦电泳等电聚焦电泳Isoelectric FocusingIsoelectric Focusing离子交换层析法离子交换层析法Ion-Exchange Chromatography根据配基特异性分离 亲和层析法：亲和层析法：根据生物分子间亲和吸附和解离的原理而建立的层析法。Affinity Chromatography原理：原理：不溶性载体特异配基目的蛋白质，其他蛋白被洗脱掉其它常用分离方法密度梯度离心法密度梯度离心法Zonal Density Gradient Centrifugation四、蛋白质的分析鉴定Folin-酚酚试剂法试剂法凯氏定氮法凯氏定氮法双缩脲法双缩脲法紫外分光紫外分光光度法光度法蛋白质含量蛋白质含量测定测定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定 方法：层析法、电泳法、免疫化学法、方法：层析法、电泳法、免疫化学法、结晶法、等电聚焦法、溶解度分析法等等。结晶法、等电聚焦法、溶解度分析法等等。常用方法：凝胶层析法、高效液相层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。五、蛋白质类药物的制备示例白蛋白人血浆络合Na2CO3调pH8.6依沙吖啶，静置分离络合物解离H2O，HCl调pH弱酸性NaCl，65，离心解离液浓缩超滤浓缩液热处理60,10h热处理液除菌除菌过滤白蛋白白蛋白制备途径：从生物材料中提取微生物发酵化学合成一、提取制备一、提取制备大分子大分子DNA的提取制备的提取制备大分子大分子RNA的提取制备的提取制备核苷酸的提取制备核苷酸的提取制备核苷的提取制备核苷的提取制备DNPDNA+蛋白质苯酚法酸水解、碱水解、酶水解浓氨水等剧烈条件二、其它制备方法二、其它制备方法天然结构物质天然结构物质类似物类似物/聚合物聚合物微生物发酵/生物材料提取化学酶合成法肌苷、鸟苷酸等肌苷、鸟苷酸等阿糖胞苷、氟尿嘧啶等阿糖胞苷、氟尿嘧啶等超速离心法超速离心法三、核酸的分离纯化三、核酸的分离纯化凝胶电泳法凝胶电泳法柱层析法柱层析法琼脂糖凝胶电泳、聚丙琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳排阻过滤层析：排阻过滤层析：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶/聚丙烯酰胺凝胶分离聚丙烯酰胺凝胶分离RNA；琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNA离子交换层析：离子交换层析：DEAE-纤维素纤维素其它：反相层析等其它：反相层析等_+Agarose mesh凝胶电泳法凝胶电泳法四、核酸的含量测定方法四、核酸的含量测定方法定磷法定磷法定糖法定糖法紫外分光紫外分光光度法光度法方法方法A260nm0.022（1g/mlRNA）A260nm0.020（1g/mlDNA）（加热条件下）（加热条件下）D-D-核糖浓盐酸地衣酚核糖浓盐酸地衣酚绿色（绿色（670nm670nm）D-2-D-2-脱氧核糖酸二苯胺脱氧核糖酸二苯胺蓝色（蓝色（595nm595nm）有机磷消化有机磷消化钼蓝钼蓝660nm660nmRNA:8.59.0%DNA:9.2%第三节第三节 酶类药物的工业生产酶类药物的工业生产 酶在临床上用于疾病治疗已有悠久酶在临床上用于疾病治疗已有悠久的历史。由于酶是生理、生化过程的重要的历史。由于酶是生理、生化过程的重要参与者，酶量的多少和活性的高低，直接参与者，酶量的多少和活性的高低，直接关系到人的健康水平。因此，用酶治疗疾关系到人的健康水平。因此，用酶治疗疾病有着十分广阔的前景。病有着十分广阔的前景。l酶类药物获取途径有两种：酶类药物获取途径有两种：动植物和微生物直接提取动植物和微生物直接提取微生物发酵生产微生物发酵生产l酶的制备一般包括四个基本步骤：酶的制备一般包括四个基本步骤：预处理预处理提取提取纯化纯化结晶或制剂结晶或制剂（一）生物材料的预处理（一）生物材料的预处理胞内酶要通过破碎细胞把酶释放，再进行抽胞内酶要通过破碎细胞把酶释放，再进行抽提提酶类提取采用的常用细胞破碎方法有：酶类提取采用的常用细胞破碎方法有：机械法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将机械法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎细胞破碎 物理法：利用温度差、压力差或超声波等将物理法：利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎细胞破碎化学法：指利用盐、碱、表面活性剂、化学法：指利用盐、碱、表面活性剂、甲醛、丙酮等有机溶剂作用于细胞甲醛、丙酮等有机溶剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变发生改变 酶解法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破酶解法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎冻融法：反复冷冻与融化交替使细胞破碎冻融法：反复冷冻与融化交替使细胞破碎空气干燥法空气干燥法干燥法真空干燥法干燥法真空干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法（二）酶的提取（二）酶的提取酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。提取液中的过程。提取方法：水溶解法、有机溶剂法、表面活性提取方法：水溶解法、有机溶剂法、表面活性剂法剂法为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温度和提取过程中必须注意保持适宜的温度和pHpH，并，并且添加适量的保护剂。且添加适量的保护剂。水溶液法：常用稀盐溶液或缓冲溶液提取。水溶液法：常用稀盐溶液或缓冲溶液提取。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温失活，提取过程中必须注意保持适宜的温度和度和pHpH，并且添加适量的保护剂。，并且添加适量的保护剂。有机溶剂法：常用有机溶剂是丁醇。有机溶剂法：常用有机溶剂是丁醇。均相法均相法丁醇提取丁醇提取二相法二相法（三）酶的纯化（三）酶的纯化、杂质的去处、杂质的去处pHpH和加热法和加热法蛋白质表面变性法蛋白质表面变性法蛋白质沉淀剂法蛋白质沉淀剂法选择性变性法选择性变性法加保护剂热变性法加保护剂热变性法核酸沉淀剂法核酸沉淀剂法将酶与底物结合将酶与底物结合、脱盐、脱盐（）透析（）透析（）凝胶过滤（）凝胶过滤（四）酶的结晶（四）酶的结晶、盐析法、盐析法、有机溶剂法、有机溶剂法（五）酶类药物生产（五）酶类药物生产(自学见书自学见书P50）u在酶的提取纯化过程中应该注意在酶的提取纯化过程中应该注意 1、防止酶蛋白变性防止酶蛋白变性。低温、快速、不能过度搅拌。低温、快速、不能过度搅拌。全部操作需在低温下进行，一般在全部操作需在低温下进行，一般在 05，用，用有机溶剂沉淀时，在零下有机溶剂沉淀时，在零下1520下进行。下进行。2、在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量、在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量少量-巯基乙醇。巯基乙醇。3、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算总、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算总活力和比活力。活力和比活力。4、酶制剂的纯度应与使用目的相适应、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。T 酶在医药学上的应用酶在医药学上的应用一、酶在疾病诊断上的应用一、酶在疾病诊断上的应用 血清酶的测定血清酶的测定二、酶在治疗上的应用二、酶在治疗上的应用 VB1B1、V VB6B6、V VD D等等发酵法：发酵法：如如V VB1B1、V VB2B2、V VC C、V VA A原等原等生物提取法：生物提取法：如如V VB12B12等等维生素类药物生产示例维生素类药物生产示例V VC C单糖：单糖：葡萄糖、果糖等葡萄糖、果糖等低聚糖：低聚糖：蔗糖等蔗糖等多糖：多糖：葡聚糖等葡聚糖等糖衍生物：糖衍生物：6 6磷酸葡萄糖等磷酸葡萄糖等多糖药物的制备多糖药物的制备多糖提取多糖提取粗提粗提去蛋白去蛋白去离子去离子醇沉醇沉 稀碱提取（0.5mol/LNaOH）：难溶难溶于水者，主要为胶类于水者，主要为胶类 热水提取：难溶于冷水和乙醇者难溶于冷水和乙醇者 粘多糖提取：水水/盐溶液提取；盐溶液提取；碱解法、酶解法碱解法、酶解法 如三氯乙酸、鞣酸、磷钨酸磷如三氯乙酸、鞣酸、磷钨酸磷钼酸或氯仿：正丁醇（钼酸或氯仿：正丁醇（5 5：1 1）等）等 透析法、纤维滤器透析法等透析法、纤维滤器透析法等 乙醇分级沉淀（多糖浓度乙醇分级沉淀（多糖浓度1 12 2）多糖纯化多糖纯化乙醇沉淀法乙醇沉淀法季铵盐络合法季铵盐络合法离子交换层析法离子交换层析法 如如CTABCTAB、CPCCPC等等 如如D D254254、DEAE-DEAE-Sephadex ASephadex A2525等等 分级分离分级分离糖类药物生产示例糖类药物生产示例透明质酸透明质酸检测方法：检测方法：ElsonElsonMorganMorgan法测氨基葡萄糖法测氨基葡萄糖 硫酸咔唑法测葡萄糖醛酸硫酸咔唑法测葡萄糖醛酸根据脂类药物的化学结构分为：1不饱和脂肪酸类 如前列腺素、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、EPA和DHA等。2磷脂类 如卵磷脂、脑磷脂等。3胆酸类 如胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、石胆酸等。4固醇类 如胆固醇、麦角固醇、-骨固醇等。5色素类 如胆红素等。脂脂脂脂类类类类药药药药物物物物的的的的提提提提取取取取 1合适的有机溶剂 如乙醚、丙酮、石油醚、二硫化碳、氯仿、己烷和苯等，或甲醇、乙醇、异丙醇等能与水混溶的溶剂2混合溶剂 常用的有氯仿甲醇、丙酮异丙醇、正丁烷异丙醇、氯仿甲醇正丁醇水0.lmolL EDTA等3超临界CO2乙醇混合物作溶剂 4气体加压成液态作溶剂 如CH4、C2H6等 脂类药物都从生物材料中提取，提取的原理即根据脂类生化药物的溶解性质，选择合适的方法。脂脂脂脂类类类类药药药药物物物物的的的的分分分分离离离离 分离纯化方法分离纯化方法分离纯化方法分离纯化方法 溶解度法溶解度法 层析分离法层析分离法 丙酮沉淀法丙酮沉淀法 有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法 结晶法结晶法离子交换法离子交换法 脂脂脂脂类类类类药药药药物物物物生生生生产产产产示示示示例例例例 前列腺素前列腺素PGEPGE2 2的技术路线的技术路线 PGEPGE2 2有促进平滑肌收缩、扩张血管及抑制胃液分泌有促进平滑肌收缩、扩张血管及抑制胃液分泌作用，也有松弛支气管平滑肌作用。临床上用于治疗哮作用，也有松弛支气管平滑肌作用。临床上用于治疗哮喘及高血压，亦可用于催产、前期及中期引产。喘及高血压，亦可用于催产、前期及中期引产。