免疫组化基本技术(三).ppt

免疫组化基本技术（三）免疫组化基本技术（三）6.6.根据本实验室经验各种不同类型组织根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件的石蜡包埋条件(1)(1)大动物组织大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间水、透明和浸蜡时间 7575乙醇乙醇3030120min120min，8585乙醇乙醇3030120min120min，9595乙醇乙醇 2h 2h，9595乙醇乙醇 2h 2h，9595乙醇乙醇过夜，无水乙醇过夜，无水乙醇303060min60min，无水乙醇无水乙醇303060min60min，无水乙醇无水乙醇60min60min120min120min，二甲苯二甲苯、和和各各15min15min（可视观察结果而定），石蜡可视观察结果而定），石蜡30min30min，石蜡石蜡112h2h，石蜡石蜡223h3h。(2)(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇30min30min，9595乙醇乙醇1h1h，1h1h，过夜或过夜或2h2h，无水乙无水乙醇醇、和和各各30min30min，二甲苯二甲苯15min,15min,10min10min，10min10min（肉眼观察），石蜡肉眼观察），石蜡30min30min，石蜡石蜡30min30min，石蜡石蜡112h2h。(3)(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间蜡时间 7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇1h1h，9595乙醇乙醇1h1h，1h1h和和4h4h或过夜，无水乙或过夜，无水乙醇醇30min30min，112h2h和和4h4h，二甲苯二甲苯30min30min，30min30min和和1h1h。七、组织切片七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，棉胶切片，IHCIHC切片要求不同与常规切切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.1.切片前的准备工作切片前的准备工作(1)(1)载玻片的清洁：载玻片的清洁：市售载玻片需经清市售载玻片需经清洁液泡洁液泡24h24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片将玻片240240烤烤2h2h。(2)(2)切片粘合剂的种类切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量多聚赖氨酸（分子量300KD300KD）：）：0.5%0.5%浓度。浓度。APESAPES试剂（试剂（3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片净载玻片丙酮丙酮5min APES5min APES（1ml+50ml1ml+50ml丙酮）：丙酮）：用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入APESAPES试剂试剂1 13 3次次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或44保存备用。保存备用。铬矾铬矾明胶液：明胶液：铬矾铬矾0.5g 0.5g 明胶明胶5g H5g H2 2O O2 2 1000ml 1000ml甲醛明胶液：甲醛明胶液：4040甲醛甲醛2.5ml 2.5ml 明胶明胶0.5g H0.5g H2 2O O2 2 100ml 100ml2.2.石蜡切片：石蜡切片：3.3.冰冻切片：冰冻切片：IHCIHC冰冻切片，冰冻切片，ISHISH冰冻切片冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)4.4.切片要求及注意事项：切片要求及注意事项：(1)(1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/31/3。(2)52(2)526060烤片烤片18h18h。(3)(3)切片厚切片厚2 24 4m m。(4)(4)切片刀要快切片刀要快 (5)(5)编上号编上号 (6)(6)切片可在切片可在44保存数年（石蜡切片）保存数年（石蜡切片）(7)(7)冰冻切片需凉干后立即固定冰冻切片需凉干后立即固定(8)(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理织需经庶糖处理24h24h，冰冻切片。冰冻切片。(9)(9)冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80-80保存备用保存备用八、组织与细胞材料的保存八、组织与细胞材料的保存 1.1.冷冻保存：冷冻保存：-80-80，-145-145，-198-198 组织应在离体组织应在离体30min30min内，快速取材，放内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。2.2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，中，-80-80冻存。冻存。3.3.蜡块的保存蜡块的保存4.4.活细胞的保存活细胞的保存 可根据需要将细胞直可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，接培养在盖玻片上，9 9孔板上的细胞可孔板上的细胞可经固定后经固定后-80-80保存备用，大容量培养保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。的细胞收集冻存在液氮中。第二部分第二部分 IHCIHC的一些基本技术的一些基本技术主要内容主要内容一、实验的设计一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法三、内源性酶的消除方法四、四、IHC的非特异性染色的非特异性染色五、抗原的暴露和修复五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、九、IHC常用缓冲液常用缓冲液一、实验的设计一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。关公司购置特异性抗体和检测试剂。2.2.列出列出IHCIHC实验操作流程，选择何种实验操作流程，选择何种IHCIHC前前 处理方式。处理方式。3.3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。应设置何种对照。4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育 时间和温度，同一的显色时间。时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准列出阳性判定的标准6.预期达到的目标预期达到的目标二、石蜡切片脱蜡至水二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从冰冻切片从-80-80取出，凉干或电吹风取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做需经如下脱蜡才能做IHCIHC。二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯二甲苯10min10min，无水乙醇无水乙醇2min2min，9595乙乙醇醇2min2min，8585乙醇乙醇2min2min，7575乙醇乙醇2min2min，流水冲洗。流水冲洗。三、内源性酶的消除方法三、内源性酶的消除方法(一一)内源性过氧化物酶的消除方法：内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液甲醇液20min 2.1 H2O2 20min 3.3苯肼溶液苯肼溶液 37 1h 4.0.075%盐酸甲醇液盐酸甲醇液 30min5.5.DAB-HDAB-H2 2O O2 2溶液中加溶液中加0.0050.005M NaN3M NaN36.6.过碘酸过碘酸-硼酸钠：硼酸钠：0.5%0.5%过碘酸过碘酸1010minmin，经洗后经洗后1 1硼酸钠处理硼酸钠处理1010minmin。7.20mol/L-100mol/L7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸抗坏血酸30306060minmin。