04第四章细胞反应动力学(CN).ppt

第四章第四章 细胞反应过程动力学细胞反应过程动力学4.1.1 简介简介一个活的细胞一个活的细胞=一个复杂的化学反应器一个复杂的化学反应器物质限制物质限制能量限制能量限制热力学原理热力学原理化学反应的一些概念也可以应用到化学反应的一些概念也可以应用到生物系统生物系统中来。中来。4.1 化学计量学化学反应化学反应2大分子大分子小分子小分子C C 源源N N 源源P P 源源S S 源源培养基培养基代谢产物代谢产物分解代谢分解代谢小分子小分子能量能量代谢：细胞内发生的所有化学反应的总和称代谢代谢：细胞内发生的所有化学反应的总和称代谢分解代谢分解代谢 营养物的降解营养物的降解合成代谢合成代谢 小分子小分子大分子大分子3培养基组成培养基组成=营养物的降解营养物的降解细胞为了生长和繁殖，必须消耗培养基中的营养成分用于合细胞为了生长和繁殖，必须消耗培养基中的营养成分用于合成细胞壁，蛋白质，酶，脂肪等物质和细胞构成单元。成细胞壁，蛋白质，酶，脂肪等物质和细胞构成单元。元素的基本来源元素的基本来源ElementSourceCarbon(C)CO2,Sugar,Proteins,fatsNitrogen(N)Proteins,NH3,NO2-Sulfur(S)Proteins,SO42-Phosphorus(P)PO43-Hydrogen(H)Oxygen(O)H2O,Medium components4产物合成产物合成醇醇(乙醇乙醇),有机酸有机酸(乳酸乳酸,柠檬酸柠檬酸,氨酸酸氨酸酸),抗生素抗生素,酶酶这些物质的大量合成，对于微生物细胞的正常功能维持可能是这些物质的大量合成，对于微生物细胞的正常功能维持可能是没有必要的或者是无用的，但对于人类却是很有价值的。没有必要的或者是无用的，但对于人类却是很有价值的。5Cell Growth And Energy ReleaseEnergy obtained from environment is stored and shuttled in high-energy intermediates,such as ATPThe cell uses this energy to perform three types of work:1.Chemical synthesis of large or complex molecules;2.Transport of ionic and neutral substrates into or out of the cell or its internal organelles;3.Mechanical work required for cell division and motion.All these processes are,by themselves,nonspontaneous,and result an increase of free energy of the cell.Consequently,they occur when simultaneously coupled to another process which has a negative free energy change of greater magnitude.6Example:Oxidation-ReductionOxidation:loses electrons,dehydrogenationReduction:addition of electrons,hydrogenationNAD:Nicotinamide Adenine DinucleotideNADP:Phosphorylated form of NADProton is provided by some coenzymes:7(II)化学计量学化学计量学 得率系数得率系数Simplest Macroscopic View of GrowthSystem:Fixed Amount of Cell MaterialSubstratesProductsCells8(a)元素平衡元素平衡Consider the following simplified biological conversion in which no extracellular products other than H2O and CO2:一个典型的细胞组成可以表示为：一个典型的细胞组成可以表示为：We postulate one mole of biological material would be defined as the amount containing one mole of carbon,such as,where :1mole of carbohydrate;:1mole of cellular material.9Simple elemental balances on C,H,O and N yield the following equations:The respiratory quotient:which denotes the moles of carbon dioxide(CO2)pro-duced per moles of oxygen(O2)consumed.It provides an indication of metabolic state,and can be used in process control.10(b)Other DefinitionsThe yield coefficientsAnaerobic conditionsAerobic conditionsHeterotrophic growth:YX/ATP=1011 gDW/ATPAutotrophic growth:YX/ATP=6.5 gDW/ATPYX/ATP10.5 gDW/ATP11RegularitySome parameters are nearly the same irrespective of the species or substrate involved:0.462 g carbon in biomass per gram of dry biomass;typical bacteria composition:CH1.8O0.5N0.2And most measured values of YX/S for aerobic growth on glucose are 0.380.51 g DW/g glucose.12YX/S值保持不变的条件值保持不变的条件：化学合成培养基化学合成培养基唯一碳源唯一碳源无胞外产物或生长偶联型无胞外产物或生长偶联型胞内不积累贮藏性能源物质胞内不积累贮藏性能源物质YX/S的应用的应用在实际发酵过程中常常随不同生理状态而变化在实际发酵过程中常常随不同生理状态而变化明确底物的消耗状况明确底物的消耗状况跟踪营养物的流向跟踪营养物的流向134.2 4.2 细胞生长动力学概述细胞生长动力学概述决定细胞反应动力学的主要因素、现象及其相互关系决定细胞反应动力学的主要因素、现象及其相互关系非生命体系非生命体系生命体系生命体系u在细胞生长的过程中，包含两个在细胞生长的过程中，包含两个相互作用相互作用的系统：的系统：培养环境培养环境细胞体细胞体培养环境培养环境l多组分多组分l液相反应液相反应l酸碱平衡酸碱平衡lpH,T等变化等变化l液体流变学变化液体流变学变化l多相多相(气、固、液气、固、液)l空间的非均一性空间的非均一性细胞体细胞体l多组分多组分l细胞异质性细胞异质性l多反应体系多反应体系l受基因调控受基因调控l自适应自适应l随机性随机性l遗传不稳定性遗传不稳定性14非生命体系非生命体系生命体系生命体系培养环境培养环境l多组分多组分l液相反应液相反应l酸碱平衡酸碱平衡lpH,T等变化等变化l液体流变学变化液体流变学变化l多相多相(气、固、液气、固、液)l空间的非均一性空间的非均一性细胞体细胞体l多组分多组分l细胞异质性细胞异质性l多反应体系多反应体系l受基因调控受基因调控l自适应自适应l随机性随机性l遗传不稳定性遗传不稳定性营养成分营养成分 底物底物产物产物热量热量机械机械相互作用相互作用u细胞消耗营养成分，将培养环境中的细胞消耗营养成分，将培养环境中的底物底物转化为转化为产物产物。u细胞在生命活动中产生细胞在生命活动中产生热量热量，与此同时，通过设置培养环境的温，与此同时，通过设置培养环境的温度控制细胞的生长或产物合成。度控制细胞的生长或产物合成。u细胞生长、增殖和代谢产物的积累，使培养环境的流变学性质细胞生长、增殖和代谢产物的积累，使培养环境的流变学性质(固含固含量、粘度量、粘度)发生改变，细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于明发生改变，细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于明显，对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。显，对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。154.2 生长动力学的定量描述n对发酵过程的动力学描述不仅对于理论研究很有用，而且能应用对发酵过程的动力学描述不仅对于理论研究很有用，而且能应用于实际优化发酵过程和反应器的设计之中于实际优化发酵过程和反应器的设计之中.n对研究系统中的各变量变化过程进行数学描述对研究系统中的各变量变化过程进行数学描述.平衡方程平衡方程(物料衡算物料衡算,能量衡算能量衡算)热力学热力学(状态方程状态方程,亨利定理亨利定理)反应速率方程反应速率方程(传质传质,细胞和产物合成速率、底物的消耗速率细胞和产物合成速率、底物的消耗速率)164.2.1 平衡方程平衡方程n平衡方程的一般形式平衡方程的一般形式l体系中的积累速率体系中的积累速率:细胞浓度细胞浓度:X(kg m-3)反应器体积反应器体积:V(m3)细胞的质量细胞的质量:VX(kg)细胞的积累速率细胞的积累速率=(kgh-1)单位体积细胞的积累速率单位体积细胞的积累速率=(kgm-3h-1)体系中的积累速率流入体系的速率体系中的积累速率流入体系的速率-流出体系的速率流出体系的速率17l流入速率与流出速率流入速率与流出速率:where F 体体积积流量流量(m3h-1)FX 质质量流量量流量(kgh-1)V 反应器体积反应器体积(m3)l下下标标,i or o,表示流入表示流入(input)或流出或流出(output)反反应应器的器的变变量量.l合成速率与消耗速率合成速率与消耗速率:细胞合成速率细胞合成速率=rX(kgm-3h-1)产物合成速率产物合成速率=rP(kgm-3h-1)底物消耗速率底物消耗速率=rS(kgm-3h-1)184.2.2 动力学模型动力学模型非非分分离离模模型型分分离离模模型型非结构模型非结构模型结构模型结构模型对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型l是否分别描述细胞的各种是否分别描述细胞的各种组成成分组成成分l是否将细胞看成是均一的是否将细胞看成是均一的种群种群19非结构模型非结构模型结构模型结构模型将细胞种群看成将细胞种群看成是均一单一组分是均一单一组分的溶质的溶质Single component heterogeneous individual cellsMulticomponent average cell description将细胞种群看成是将细胞种群看成是多组分多种群的生多组分多种群的生物系统物系统最理想的模型最理想的模型“Balance growth”(Approximation)“Balance growth”(Approximation)“Average cell”(Approximation)“Average cell”(Approximation)最接近现实的模型最接近现实的模型对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型非非分分离离模模型型分分离离模模型型20生长速率生长速率(kg m-3 h-1)底物消耗速率底物消耗速率(kg m-3 h-1)产物合成速率产物合成速率(kg m-3 h-1)符号定义符号定义比生长速率比生长速率(h-1)底物比消耗速率底物比消耗速率(h-1)产物比合成速率产物比合成速率(h-1)21细胞生长动力学细胞生长动力学(X)产物合成动力学产物合成动力学(P)底物消耗动力学底物消耗动力学(S)细胞反应动力学细胞反应动力学22细胞生长与抑制细胞生长与抑制I.底物限制生长底物限制生长A.假定一种化合物假定一种化合物S是是限制性底物限制性底物(即即S的浓度增加会影响生长的浓度增加会影响生长速率速率,而其它营养组分浓度的变化对生长速率没有影响作用而其它营养组分浓度的变化对生长速率没有影响作用).a)Monod 方程方程假设条件：假设条件：均衡生长均衡生长只有一种限制性基质只有一种限制性基质细胞得率系数为常数细胞得率系数为常数23where 比生比生长长速率速率(h-1)最大比生最大比生长长速率速率(h-1)饱饱和常数和常数(kgm-3)典型的非结构非分离动力学模型是典型的非结构非分离动力学模型是Monod equation,它的它的方程表达形式类似于酶的方程表达形式类似于酶的Michaelis-Menten 方程方程:半经验公式半经验公式24类似于酶反应动力学所提示的规律类似于酶反应动力学所提示的规律,从从Monod方程也可以推衍出一些方程也可以推衍出一些有用的结论：有用的结论：优点优点:Monod 方程能适合于许多实方程能适合于许多实验和生产过程中的微生物生长过验和生产过程中的微生物生长过程，适用面较广。程，适用面较广。缺点缺点:a.仅适用于仅适用于生长速率较慢生长速率较慢的情况的情况b.仅适用于仅适用于细胞浓度较低细胞浓度较低的条件的条件25b)对于快速生长密度较高的微生物培养过程对于快速生长密度较高的微生物培养过程:orwhere S0 底物的初始底物的初始浓浓度度 KS0 无无纲纲量系数量系数c)其它方程其它方程:优点优点:对实验数据的拟合效果优于对实验数据的拟合效果优于Monod方程方程;缺点缺点:方程不连续方程不连续.lBlackman equationlTessier 方程方程26lMoser 方程方程当当 n=1 和和Monod方程等效方程等效.lContois 方程方程一般形式下的微分方程一般形式下的微分方程:where K,a,b 常数常数S 限制性限制性浓浓度的度的浓浓度度27General form,a single differential equation:where K,a,b constantsS rate-limiting substrate concentrationConstants of the Generalized Differential Specific Growth Rate Equation for Different ModelsabKMonod021/KSTessier01KMoser1-1/n1+1/nn/KS1/nContois021/KSXX28l生长非偶联型生长非偶联型(次级代谢物次级代谢物)产物合成动力学产物合成动力学l生长偶联型生长偶联型(乙醇发酵乙醇发酵)ororP29lLeudeking-Piret 方程方程 生长半偶联型生长半偶联型:(乳酸发酵乳酸发酵)or It has proved extremely useful and versatile in fitting product formation data from many different fermentations.This is an expected kinetic form when the product is the result of energy-yielding metabolism,as in several anaerobic fermentations.30内源性的代谢维持内源性的代谢维持系数范围系数范围:ms=0.024(kg 底物底物/kg 细胞细胞h-1)在微生物不生长也不生产产物时，仍消耗底物，这是为在微生物不生长也不生产产物时，仍消耗底物，这是为了满足微生物的维持需要，支持细胞存活、细胞运动、了满足微生物的维持需要，支持细胞存活、细胞运动、酶合成、渗透压、营养贮存和其它过程。酶合成、渗透压、营养贮存和其它过程。31底物消耗动力学底物消耗动力学where the expressions of rPi could be one of the above three product formation rate equations,according to the characteristics of the corresponding product(growth-associated or not).对于有许多产物合成的发酵过程，底物的消耗速率可以表示为：对于有许多产物合成的发酵过程，底物的消耗速率可以表示为：Also,用于细胞生长用于细胞生长用于产物合成用于产物合成 代谢维持代谢维持32细胞生长动力学细胞生长动力学(X)产物合成动力学产物合成动力学(P)底物消耗动力学底物消耗动力学(S)细细胞胞反反应应动动力力学学334.3 分批培养的动力学方程生长条件是不稳定的，一直在变化的：随着细胞生长过程的进生长条件是不稳定的，一直在变化的：随着细胞生长过程的进行，反应器中的营养物浓度，细胞浓度，产物浓度都随反应时行，反应器中的营养物浓度，细胞浓度，产物浓度都随反应时间而变化。间而变化。三种培养方式三种培养方式分批培养分批培养连续培养连续培养补料补料-分批培养分批培养S,X,P=f(t)这种培养方式很简单，因此广泛地在实验室和生产实践中应用。这种培养方式很简单，因此广泛地在实验室和生产实践中应用。344.3.1 Introduction典型的大肠杆菌生长曲线典型的大肠杆菌生长曲线延滞期延滞期对数期对数期稳定期稳定期死亡期死亡期生长曲线可分为生长曲线可分为4个时期个时期.3536延滞期延滞期n接种后，细胞的生长进入延滞期。这个期间是细胞的适应调整期，接种后，细胞的生长进入延滞期。这个期间是细胞的适应调整期，细胞在一个新的环境中生存，需要根据新环境的营养特点重新调细胞在一个新的环境中生存，需要根据新环境的营养特点重新调整细胞体内的酶系及代谢过程，以使自身能适应新的环境并开始整细胞体内的酶系及代谢过程，以使自身能适应新的环境并开始生长和繁殖。生长和繁殖。n怎样减少延滞期的时间怎样减少延滞期的时间?l可以让细胞有一个预适应的过程，种子的二级培养。可以让细胞有一个预适应的过程，种子的二级培养。l种龄是对数期的（年青，有生命力）种龄是对数期的（年青，有生命力）l加大接种量加大接种量l优化培养基的培养条件（化学组成和物理条件）优化培养基的培养条件（化学组成和物理条件）l加入一些生长因子（微量元素，维生素等）加入一些生长因子（微量元素，维生素等）37n当培养基中含有当培养基中含有2种碳源时，可能会有多个延滞期的出现。种碳源时，可能会有多个延滞期的出现。这种现象称为这种现象称为二次生长二次生长.当一种碳源被利用完后，细胞还需重新调整细胞体内的酶系和代谢当一种碳源被利用完后，细胞还需重新调整细胞体内的酶系和代谢途径以适应另一种碳源的利用，这需要一个调整的过程。途径以适应另一种碳源的利用，这需要一个调整的过程。二次生长二次生长38对数生长期对数生长期(Exponential Growth Phase)n延滞期结束后，微生物适应了新的环境，其生长过程进入延滞期结束后，微生物适应了新的环境，其生长过程进入倍增生长倍增生长的过程，生物量或微生物的数目随着分裂周期而的过程，生物量或微生物的数目随着分裂周期而倍增倍增。n对数生长速率方程符合一级动力学方程对数生长速率方程符合一级动力学方程with X=X0,at t=0 =constant积分得到积分得到,or对数生长的特征是：在半对数坐标系中，以对数生长的特征是：在半对数坐标系中，以lnX 对对 t 作图作图,得到一条得到一条直线。直线。39n细胞的倍增时间细胞的倍增时间:ttlnXX40稳定期稳定期n在稳定期时在稳定期时,细胞的细胞的净生长速率净生长速率为为0,即生长速率即生长速率=死亡速率死亡速率n但是在稳定期时，细胞仍保持着代谢活力并合成但是在稳定期时，细胞仍保持着代谢活力并合成次级代谢产物次级代谢产物,（非偶联型代谢产物非偶联型代谢产物）.死亡期死亡期n在稳定期结束时，随着在稳定期结束时，随着营养物耗竭营养物耗竭，或者是，或者是有害代谢副产物有害代谢副产物的积累，的积累，导致细胞的生长进入导致细胞的生长进入死亡期死亡期。n细胞的死亡速率一般遵循细胞的死亡速率一般遵循一级一级反应动力学反应动力学积分得到积分得到,where,Xv 活细胞浓度活细胞浓度XS是稳定期时的细胞浓度是稳定期时的细胞浓度414.3.2 分批发酵动力学分批发酵动力学(是一个非稳态的过程是一个非稳态的过程)对于分批培养对于分批培养:Fi=Fo=0,then dV/dt=0where rSX 用于用于细胞生长细胞生长的底物消耗的底物消耗;rSm用于用于代谢维持代谢维持的底物消耗的底物消耗 rSP用于用于产物合成产物合成的底物消耗的底物消耗42细胞生长速率细胞生长速率:产物合成速率产物合成速率:底物消耗速率底物消耗速率:当代谢维持可以忽略时当代谢维持可以忽略时.注意：注意：不是一个常数不是一个常数43I.应用应用Monod 方程并且不考虑产物的合成，也不考虑代谢维持，方程并且不考虑产物的合成，也不考虑代谢维持，只考虑细胞的生长和底物的消耗时（简化模型）只考虑细胞的生长和底物的消耗时（简化模型）积分积分(比生长速率比生长速率)(细胞对底物得率细胞对底物得率)这时，这时，YX/S是一个恒定值，且是一个恒定值，且4445If X00,then,对于分批培养对于分批培养XXoptrX,optS0SoptrX,opt464.4 参数估计参数估计积分法积分法 微分法微分法 实验测得实验测得S(t),X(t),求解微分方程组求解微分方程组,线性化或数值解线性化或数值解实验测得反应速率实验测得反应速率，直接由速率方程估计参数直接由速率方程估计参数474.4.1 积分法积分法 仅能应用于简单的动力学模型First-order kineticsZero-order kineticsGrowth associated product accumulationLogistic equationMonod equation48Monod方程的解析解方程的解析解(1)(2)(3)将将(3)代入代入(2)得：得：(4)49将将(1)式变形式变形(5)将将(5)式代入式代入(4)式得：式得：(6)分离变量后积分得：分离变量后积分得：式中式中A和和B是与动力学参数有关的复合参数。是与动力学参数有关的复合参数。504.4.2 微分法微分法 比生长速率比生长速率,实验数据实验数据,X-t,S-t,-t线性化线性化,51tX,SS1/SSS/1/1/max-1/KSKS/max1/maxKS/max-KS52数值计算求解数值计算求解非线性微分方程的数值求解非线性微分方程的数值求解,Runge-Kutta method,(Matlab命令命令:ode45,ode23.)优化计算优化计算依赖域法依赖域法 或或 遗传算法遗传算法(commands in Matlab:lsqnonlin,fmincon,lsqcurvefit)Least-squares method(最小二乘法最小二乘法)53积分法积分法微分法微分法S(t),X(t)例例例例4-1 Monod 4-1 Monod 方程参数的实验测定：方程参数的实验测定：方程参数的实验测定：方程参数的实验测定：以乳糖为唯一碳源以乳糖为唯一碳源以乳糖为唯一碳源以乳糖为唯一碳源分批培养分批培养分批培养分批培养细菌，底物消耗与菌体生物量的过程曲线数细菌，底物消耗与菌体生物量的过程曲线数细菌，底物消耗与菌体生物量的过程曲线数细菌，底物消耗与菌体生物量的过程曲线数据如表据如表据如表据如表4A4A所示所示所示所示(Page162)(Page162)。假设菌体生长符合。假设菌体生长符合。假设菌体生长符合。假设菌体生长符合MonodMonod方程。方程。方程。方程。544.5 细胞反应动力学的结构模型细胞反应动力学的结构模型 结构模型结构模型(Structured Model)分离模型分离模型(Segregated Model)55I.结构模型结构模型葡萄糖葡萄糖GE磷酸盐磷酸盐PE胞内磷酸盐胞内磷酸盐P贮藏性碳源贮藏性碳源C高能磷酸化合物高能磷酸化合物E结构性生物质结构性生物质B葡萄糖葡萄糖G次级代谢产物次级代谢产物LrPrCrErBrLrEBrP,extrG,ext56II.分离模型分离模型许多微生物在生长过程中，当细胞成熟到一许多微生物在生长过程中，当细胞成熟到一定阶段后才能产生产物，而另一部分不能产定阶段后才能产生产物，而另一部分不能产生产物。根据细胞成熟与否将细胞分为二个生产物。根据细胞成熟与否将细胞分为二个种群（未成熟的种群（未成熟的X1和成熟的和成熟的X2），而成熟的），而成熟的细胞细胞X2能繁殖成为未成熟细胞并产生产物。能繁殖成为未成熟细胞并产生产物。假设成熟的过程符合一级反应动力学，而细假设成熟的过程符合一级反应动力学，而细胞繁殖的过程符合胞繁殖的过程符合Monod方程，产物的合方程，产物的合成与成熟细胞的生长相关。则由右图的物理成与成熟细胞的生长相关。则由右图的物理模型可得：模型可得：XX1+X2产物产物P未成熟细胞未成熟细胞成熟成熟km分裂繁殖分裂繁殖m mX1X2成熟细胞成熟细胞底物底物Sa a57III.代谢模型代谢模型葡萄糖葡萄糖(S)乙醇乙醇(E)ABa1xrAa3xrBrCrAa2xrA基质消耗基质消耗rB酵解酵解芽生过程芽生过程葡萄糖作为基质葡萄糖作为基质乙醇作为基质乙醇作为基质在代谢过程中，假设：在代谢过程中，假设：人为地将酵母分为两部分人为地将酵母分为两部分A和和B一方面，一方面，A部分酵母利用消耗葡萄糖产生乙醇、能量并生长形成部分酵母利用消耗葡萄糖产生乙醇、能量并生长形成B部分酵母部分酵母另一方面，另一方面，A部分酵母消耗乙醇产生能量和生长形成部分酵母消耗乙醇产生能量和生长形成B部分酵母部分酵母B部分酵母以一定的速率转化为部分酵母以一定的速率转化为A部分酵母（符合一级反应动力学）部分酵母（符合一级反应动力学）58根据上面的代谢结构图，可以写出方程根据上面的代谢结构图，可以写出方程式中，式中，rA,rB,rC 是三个过程的生长速率是三个过程的生长速率(见上一页的模型图见上一页的模型图)a1,a2,a3为各自的得率系数为各自的得率系数式中，式中，KS和和KE是酵母是酵母A分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的饱和常数分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的饱和常数 m mm1和和m mm2是酵母是酵母A分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的最大比生长速率分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的最大比生长速率 k是是B转化为转化为A的速率常数的速率常数59