兽医微生物1.ppt

大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌（Escherichia coli)Lecture 3v大肠杆菌是寄居肠道的优势菌丛之一，大多大肠杆菌是寄居肠道的优势菌丛之一，大多对人体无害对人体无害；人们很早发现如果大肠杆菌远人们很早发现如果大肠杆菌远离肠道，侵入其它组织和血液，就可引起离肠道，侵入其它组织和血液，就可引起化化脓脓性炎症或败血症。性炎症或败血症。v大肠杆菌对肠道致病性的认识较晚，直到大肠杆菌对肠道致病性的认识较晚，直到2020世纪世纪4040年代发现某些血清型大肠杆菌是暴发年代发现某些血清型大肠杆菌是暴发婴儿腹泻的病因后，各方面的研究才取得了婴儿腹泻的病因后，各方面的研究才取得了较大的进展。较大的进展。v引起急性肠炎的致病性大肠杆菌是通过粘引起急性肠炎的致病性大肠杆菌是通过粘附因子（又名定殖因子）粘附到肠上皮细附因子（又名定殖因子）粘附到肠上皮细胞、红细胞和白细胞的表面而发病。胞、红细胞和白细胞的表面而发病。v大肠杆菌的致病因子包括毒素（肠毒素、大肠杆菌的致病因子包括毒素（肠毒素、类类志贺氏菌毒素、黏附因子及毒力岛）。志贺氏菌毒素、黏附因子及毒力岛）。肠毒素肠毒素(enterotoxin)n分为耐热肠毒素分为耐热肠毒素(ST)、不耐热肠毒素不耐热肠毒素(LT)；nST可分为可分为STa和和STb；nST 可结合于十二指肠及回肠细胞表面的受可结合于十二指肠及回肠细胞表面的受体，激活鸟苷酸环化酶体，激活鸟苷酸环化酶(GC)，引起引起GMP的的水平增加，导致肠细胞内水和电解质代谢的水平增加，导致肠细胞内水和电解质代谢的紊乱。紊乱。nLT由由A B两种亚单位组成的两种亚单位组成的AB5型杂六聚体型杂六聚体蛋白；蛋白；nA亚单位具有亚单位具有ADP一核糖基化酶活性；一核糖基化酶活性；nB亚单位具有受体结合功能；亚单位具有受体结合功能；nB与神经节苷脂受体结合结合，通过一系列与神经节苷脂受体结合结合，通过一系列的运输途径，导致肠道液体分泌，同时抑的运输途径，导致肠道液体分泌，同时抑制肠道的吸收，导致腹泻制肠道的吸收，导致腹泻。类志贺氏菌毒素类志贺氏菌毒素(Stx)n对对vero细胞有毒性；细胞有毒性；n包括包括Stx1和和Stx2两种；两种；n具有具有AB5的蛋白结构；的蛋白结构；n有很强的细胞毒、肠毒和神经毒作用；有很强的细胞毒、肠毒和神经毒作用；nStx2有有Stx2e,Stx2eha,Stx2ehb,Stx2ea等变种。等变种。nStx2e可引起断奶仔猪水肿病；可引起断奶仔猪水肿病；n其受体其受体Gb4存在于存在于Vero细胞和仔猪细胞和仔猪小肠上皮细胞上；小肠上皮细胞上；nStx2e可阻遏猪主动脉内皮细胞的蛋可阻遏猪主动脉内皮细胞的蛋白质合成。白质合成。Stx2e黏附素性菌毛黏附素性菌毛(adhesive fimbriae）n与细菌的黏附有关；与细菌的黏附有关；n普通菌毛：甘露糖敏感的血凝反应；普通菌毛：甘露糖敏感的血凝反应；n性菌毛：在细菌之间传递性菌毛：在细菌之间传递DNA；n宿主特异性菌毛：一般为甘露糖抵抗的血凝宿主特异性菌毛：一般为甘露糖抵抗的血凝反应，是大肠杆菌致病的首要因子，包括：反应，是大肠杆菌致病的首要因子，包括：K88(F4)、K99（F5）、）、987P、F41、F18；毒力岛毒力岛(pathogenicity island；PAI)n分子量较大分子量较大(通常通常30kb)；n G+C mol%及密码子的使用与宿主菌染色及密码子的使用与宿主菌染色体有明显差异；体有明显差异；n与与tRNA位点及噬菌体整合位点邻近；位点及噬菌体整合位点邻近；n携带潜在的可移动成分，不稳定；携带潜在的可移动成分，不稳定；nLEE毒力岛和毒力岛和HPI毒力岛。毒力岛。LEE(locus of enterocyte effacement)毒力岛毒力岛n常见于常见于EPEC和和EHEC；n产生产生A/E损伤；损伤；n35.5kb，编码：编码：3型分泌系统型分泌系统(esc或或sep)、分泌型蛋白质分泌型蛋白质(esp)及其分子及其分子伴侣、外膜蛋白紧密素伴侣、外膜蛋白紧密素(eaeA)、紧密紧密素易位受体素易位受体(tir)等的基因以及调节蛋等的基因以及调节蛋白基因白基因(ler)。耶尔森氏菌强毒力岛耶尔森氏菌强毒力岛(high pathogenicity island,HPI)n最早发现于耶尔森菌属，与小鼠致死表型最早发现于耶尔森菌属，与小鼠致死表型密切相关；密切相关；nHPI毒力岛的基因模式图：毒力岛的基因模式图：nHPI核心，包括核心，包括Ybt生物合成、调控和生物合成、调控和摄取基因等；摄取基因等；nHPI作用机制：作用机制：Ybt（铁载体）从宿主摄取铁，导铁载体）从宿主摄取铁，导致宿主铁缺乏，而铁是许多酶的辅基，致宿主铁缺乏，而铁是许多酶的辅基，因为铁的缺乏而导致一系列的功能紊因为铁的缺乏而导致一系列的功能紊乱。乱。根据致病性大肠杆菌的抗原（根据致病性大肠杆菌的抗原（O O）和鞭毛抗原（和鞭毛抗原（H H）不同的血清型，将致病性大肠杆菌分为五大类：不同的血清型，将致病性大肠杆菌分为五大类：v一类：产肠毒素大肠杆菌肠炎（一类：产肠毒素大肠杆菌肠炎（ETECETEC）v二类：肠致病性大肠杆菌肠炎（二类：肠致病性大肠杆菌肠炎（EPECEPEC）v三类：肠侵袭性大肠杆菌肠炎（三类：肠侵袭性大肠杆菌肠炎（EIECEIEC）v四类：肠出血性大肠杆菌肠炎（四类：肠出血性大肠杆菌肠炎（EHECEHEC）v五类：肠粘附性大肠杆菌肠炎（五类：肠粘附性大肠杆菌肠炎（EAECEAEC）第一类：产肠毒素大肠杆菌肠炎（第一类：产肠毒素大肠杆菌肠炎（ETECETEC）：）：vETECETEC主要致病作用是由于产生不耐热肠毒素主要致病作用是由于产生不耐热肠毒素（LTLT）和耐热肠毒素（和耐热肠毒素（STST）。）。vLTLT的结构和发病机理与霍乱相似；的结构和发病机理与霍乱相似；STST也能增加肠也能增加肠液分泌，均可引起水泻。液分泌，均可引起水泻。vETECETEC只粘附于肠上皮表面，不损害也不侵入上皮只粘附于肠上皮表面，不损害也不侵入上皮细胞，故不产生脓血便属分泌性腹泻。细胞，故不产生脓血便属分泌性腹泻。第二类：肠致病性大肠杆菌肠炎（第二类：肠致病性大肠杆菌肠炎（EPECEPEC）：）：vEPECEPEC籍菌毛粘附于十二指肠、空肠、回肠上段粘籍菌毛粘附于十二指肠、空肠、回肠上段粘膜上皮细胞，可使局部微绒毛萎缩，甚至导致肠膜上皮细胞，可使局部微绒毛萎缩，甚至导致肠粘膜坏死及溃疡。粘膜坏死及溃疡。v发病多缓慢，轻者不发热，黄色蛋花样稀便，日发病多缓慢，轻者不发热，黄色蛋花样稀便，日解解3 35 5次，重者类似急性菌痢，可有粘液脓血便次，重者类似急性菌痢，可有粘液脓血便属侵袭性腹泻。属侵袭性腹泻。v确诊需要大便培养出特异血清型大肠杆菌。确诊需要大便培养出特异血清型大肠杆菌。第三类：肠侵袭性大肠杆菌肠炎（第三类：肠侵袭性大肠杆菌肠炎（EIECEIEC）：）：vEIEC EIEC 不产生肠毒素，主要侵犯结肠粘膜，形成不产生肠毒素，主要侵犯结肠粘膜，形成肠壁溃疡，致病力强。肠壁溃疡，致病力强。v临床表现有发热、头痛、全身酸痛等全身毒血症临床表现有发热、头痛、全身酸痛等全身毒血症症状以及腹痛、腹泻、里急后重、粘液脓血便等症状以及腹痛、腹泻、里急后重、粘液脓血便等酷似急性酷似急性细细菌性痢疾，属侵袭性腹泻。菌性痢疾，属侵袭性腹泻。vEIECEIEC抗体呈抗体呈4 4倍以上升高有诊断意义，大便培养出倍以上升高有诊断意义，大便培养出特异性血清型的大肠杆菌可确诊。特异性血清型的大肠杆菌可确诊。第四类：肠粘附性大肠杆菌肠炎（第四类：肠粘附性大肠杆菌肠炎（EAECEAEC）：）：vEAECEAEC不产肠毒素及不产肠毒素及VeroVero毒素，无侵袭力，能粘附毒素，无侵袭力，能粘附于小肠粘膜上皮细胞，在其表面大量繁殖并引起于小肠粘膜上皮细胞，在其表面大量繁殖并引起微绒毛改变。微绒毛改变。v为旅游者腹泻及小儿慢性腹泻的病原体，属分泌为旅游者腹泻及小儿慢性腹泻的病原体，属分泌性腹泻，性腹泻，70708080为健康带菌者。为健康带菌者。基因组与质粒（一）染色体和基因组n在大肠杆菌，目前已经完成K12菌株MG1655、EHEC O157：H7菌株EDL933和Sakai以及UPEC菌株CFT073的染色体基因组测序。大肠杆菌K12菌株的染色体基因图谱n大肠杆菌K-12菌株MG1655为非致病性菌株，该菌株基因组(Blattner FR等)大小为4639221bp，编码4288个蛋白质，38%的基因功能尚不清楚。n基因组织严密，大部分基因朝向一个方向，基因组还含有一些插入序列（IS）、噬菌体以及其他外源DNA成分。nEHEC O157：H7菌株EDL933的基因组序列(Perna等)和大肠杆菌K12的基因组相比较，发现了1387个新的基因,基因的横向转移比以前想象的更加广泛。nUPEC菌株CFT073的全基因组序列(Welch RA等)与大肠杆菌K12菌株MG1655及EHEC菌株EDL933的全基因组序列进行比较，仅有39.2%的蛋白质在所有三株菌中是共有的。和O157：H7比较，CFT073缺乏型分泌系统的基因，缺乏噬菌体或质粒编码的毒素基因，但有丰富的菌毛黏附素、自动转运系统、离子吸收系统及重组酶基因。O岛、S岛和K岛:通常将大肠杆菌K12MG1655菌株特异性的序列命名为K岛，将大肠杆菌O157：H7EDL933菌株特异性的序列命名为O岛，Sakai株特异性的序列命名为S岛。O岛、S岛和K岛的概念是毒力岛（pathogenicity island)的延伸。nEDL933菌株有分子量大于50bp的177个O岛和234个K岛。在177个O岛中，分子量在5kb以下的有130个(大多数没有编码任何基因)，在510kb的有23个，10kb以上的有24个。n有21个O岛编码的基因产物和已报道的毒力因子或潜在的毒力因子在氨基酸水平有一定的同源性，提示可能与毒力有关，如溶血素、菌毛、侵袭性相关蛋白、铁代谢、脂代谢、糖代谢等。上述不包括著名的LEE毒力岛。（二）EPEC和EHEC的致病岛n出血性大肠杆菌（代表菌株EHEC O157：H7）和致病性大肠杆菌（代表菌株EPEC E2348/69），无论在基因结构上还是在致病机理方面都具有许多共性。其中最重要的是它们都可以引起一种特征性的肠道组织病理学变化，称之为“黏附/脱落病变（Attaching and effacing,A/E)”，其特征病变是细菌与上皮细胞间紧密结合，肠上皮细胞微绒毛脱落。而引起这种A/E病变的基因基础是由于均具有被称为肠细胞脱落位点的致病岛（The Locus of Enterocyte Effacement,LEE)。nLEE可被分为三个功能区。中间区域是eae基因和Tir基因编码区。eae编码着一个9497KDa的外膜蛋白，即亲合蛋白(intimin),它是一种肠细胞黏附因子，即细菌紧密附着所必需的一种外膜蛋白。nTir编码Tir蛋白(紧密素易位受体),通过型分泌系统定位于宿主细胞上，进入宿主细胞后，它起到亲合蛋白受体的作用。一旦亲合蛋白与Tir发生结合，亲合蛋白就传导信号到宿主细胞，Tir可能还 作用于真核宿主细胞的肌动蛋白。在Tir和eae基因之间是cesT基因，它编码着Tir蛋白的一种伴侣蛋白。n在LEE的右侧是EspA、EspB、EspD和EspF基因,编码信号传导和AE损伤活性所必需的分泌性蛋白。EspA、EspB、EspD中任何一个基因突变都会使细菌丧失A/E表型，而EspF的突变则对A/E表型无明显影响。nKnuttou等最近报道，EspA蛋白在EPEC表面形成一种丝状结构，并认为Tir以及其它EPEC蛋白就是通过这种蛋白所形成的管道进入宿主细胞的。最近的研究表明EspB蛋白可转移到宿主细胞膜和胞质中，它可在宿主细胞膜上形成孔洞而作为EspA丝状结构的远端。EspD蛋白的功能尚不清楚。n在LEE的左段是编码型分泌系统的一系列基因，分泌蛋白质包括EspA、EspB、EspD所必需的。n在LEE位点上还有一些功能还不太清楚的编码基因。通过对EHEC O157：H7菌株EDL933与EPEC E2348/69的LEE基因序列比较分析研究表明：n两者的主要区别在于O157：H7 LEE长一些，有43359bp，而E2348/69 只有35624bp。这种差异主要是由于O157：H7 LEE含有一个与P4前噬菌体家族同源的7.5kb的前噬菌体引起。这个前噬菌体被命名为933L，它位于紧靠selC位点的LEE一端。前噬菌体是在LEE整合到细菌染色体之后才插入的。nLEE中其余的41个基因（ORF）在EPEC和EHEC都存在，平均核苷酸同源性是93.9%，编码型分泌系统的esc基因具有高度保守性，核苷酸同源性在98100%之间。然而编码那些直接与宿主细胞作用的蛋白质基因序列有很大的不均一性，编码亲合蛋白的eae基因有87.23%同源性，且绝大部分异源性都处于3端，而3端基因编码着受体结合区。nEPEC和O157：H7之间的差异可能是由于自然选择的结果，以致于菌株不但能很好的适应宿主特异性而且有利于逃避宿主的免疫系统。（三）质粒n致病性大肠杆菌通常携带有毒性基因质粒。研究的比较清楚的有EHEC菌株O157：H7的pO157质粒和EPEC的EAF质粒。nEHEC菌株EDL933的pO157质粒，发现于大部分EHEC O157：H7菌株中，它与病原性的关系尚不清楚，一般认为与溶血活性，黏附有关，还发现有型分泌系统操纵子，丝氨酸蛋白酶，过氧化氢酶-过氧化物酶基因。该质粒的基因组序列已测序完成，共有100个开放阅读框架，其中42个与已知基因高度同源，22个找不到和已知蛋白质有同源性。EPEC一般都有一个69kb的EAF质粒,EAF质粒的大小为5070Mda，和LA（Localized adherence）形成有关。这个质粒的丢失会导致细菌失去局灶性黏附能力，将这个质粒转移到非黏附性大肠杆菌HB101中会使这种细菌也能黏附Hep-2细胞。此外，已知ETEC菌株的LT和ST毒素及定居因子菌毛均有同一质粒编码，EIEC菌株含有一220240kb毒性质粒，EaggEC菌株的EAST1也由一大的质粒编码。毒力因子和毒力基因n大肠杆菌的病原性是由许多致病因子综合作用的结果，它们包括黏附因子，宿主细胞的表面结构、侵袭素及许多不同的毒素及分泌这些毒素的系统，致病因子在各种致病性大肠杆菌中的分布见表。致病因子在各种致病性大肠杆菌中的分布nVirulence factor ETEC EPEC EHEC EIEC EAEC UPEC NMECnToxinsToxinsnShiga toxin 1(Stx1)+nShiga toxin 2(Stx2)+nHeat-labile toxin 1(LT1)+nHeat-labile toxin 2(LT2)+anHeat-stable toxin (Sta)+nHeat-stable toxin (STb)+anLow-MW heat-stable toxin(EAST1)+n-Hemolysin(Hly)+b +nEHEC hemolysin(Ehx)+cnCytotoxic nerotizing factor 1(CNF1)+nAdhesinsAdhesinsnP fimbriae +nS fimbriae +nF1C fimbriae +nColonization factor antigen(CFA/)+nColonization factor antigen(CFA/;CS3)+nBundle-forming pilus(Bfp)+nAggregative adherence fimbriae(AAF/)+nIntimin(eae)+nInvasinsInvasinsnInvasion plasmid antigen(Ipa)+nIron acquisitionIron acquisitionnAerobactin +nCapsuleCapsulenK1 capsule antigen +nK5 capsule antigen +ETEC的毒力因子主要有两个方面，一是产生定居因子，二是产生肠毒素。尽管ETEC在体外细胞培养试验中表现一定的侵袭力，而且从ETEC中也发现了编码侵袭素的Tia毒力岛，但其侵袭作用尚无在体内得到证实。nEPEC感染的特征是引起所谓的黏附与脱落（A/E）组织学病变。而引起这种A/E病变的基因基础是由于均具有LEE致病岛。nBaldini等的研究表明EPEC菌株E2348/69（O127：H6）的局灶性黏附必须有一个60MDa的质粒存在，这个质粒被命名为EPEC的黏附因子（EPEC adherence factor,EAF)质粒。n细菌对宿主细胞的黏附是由质粒编码的束状菌毛（Bundle forming pilus,BFP)启动的。除BFP外，EPEC产生棒状菌毛（Rod-like fimbriae），一些EPEC菌株也产生EAST1，其作用现在还不知道。n研究表明在EAF质粒上一个含13个基因的基因簇对BFP的表达和组装是必须的。此外，BFP的表达与组装需要EPEC致病性调控因子Per（也叫BfpTWV）和染色体上的dsbA基因编码一种酶的参与，这种酶可以介导蛋白质二硫键的形成。1、志贺毒素（Stx）Stx家族为A-B亚基的基本结构。大肠杆菌产生的Stx包含两个免疫学上没有交叉反应的群，分别命名为Stx1和Stx2。Stx1与Stx2在A和B 亚基上各有55%和57%的序列相同。一株EHEC可能只产生Stx1、Stx2或者两者都产生。Stx1的序列是高度保守的，序列的变化主要存在于Stx2，出现了Stx2c、Stx2d、Stx2e等亚型。Stx是由插入到细菌染色体上的样原噬菌体所编码，在O157：H7EDL933菌株中，Stx1是由隐性原噬菌体933v编码，而Stx2是由温和性原噬菌体933w编码。由于Stx是由原噬菌体所编码，因此它具有不稳定性，它能够从菌株染色体中丢失，也能在不同的菌株之间水平转移。2、pO157 EHEC O157菌株含有一个高度保守性的质粒。该质粒编码肠溶血素、过氧化物酶和可能的黏附因子，他们在EHEC致病性上的作用尚不清楚。3、肠道聚集黏附大肠杆菌耐热肠毒素（EAST1）最初发现于EAggEC，但也发现于EHEC中，编码EAST1的基因是astA基因。EAST1在EHEC引起疾病中的作用尚未确定，可能与非出血性腹泻发生有关。4、离子转移 大肠杆菌O157有一个特殊的离子转移系统，可以使该菌有效的利用血红素或血红蛋白作为铁源。在铁分缺少的情况下，该菌合成一个69KDa外膜蛋白，编码该外膜蛋白的基因称为chuA（E.coli hemeutilization)基因。此外O157 LPS（以及其他菌的LPS）可以加强Stx对人血管上皮细胞的细胞毒性，但在体内的作用尚不清楚1.大肠杆菌的致病类型变化多端，致病机理各不一样，一些新出现的病原菌，如大肠杆菌O157有着极强的致病力。2.病原性大肠杆菌的毒性因子由不同的基因元件所编码，如质粒，噬菌体，转座子和毒力岛等，病原菌特异的毒性因子可对真核细胞生长发育的整个过程产生影响，包括蛋白质合成，细胞分裂，离子分泌和信号传导等。3.大肠杆菌的许多重要的毒性基因是在进化过程中获得的，这些基因在感染过程中发挥了关键的作用，目前，已从大肠杆菌中鉴定出了许多毒性基因，而且大部分位于转移性遗传物质上，因此，毒性基因在一些菌株的重新组合就可能出现新的病原性菌株。4.对大肠杆菌的诊断、治疗和预防提出新的挑战。