Viperin的生物学特性、表达调控及抗病毒作用,免疫学论文.docx

Viperin的生物学特性、表达调控及抗病毒作用,免疫学论文摘 要： 病毒感染激活宿主细胞先天性免疫信号通路级联反响，通过产生干扰素、抗病毒蛋白等来限制病毒复制和防止感染。Viperin是一种在物种间相对保守、介入先天性免疫的内质网相关抗病毒蛋白，通过与病毒蛋白、某些细胞内蛋白的互相作用调节信号转导经过，发挥抑制多种病毒增殖的广谱抗病毒作用。当前，对Viperin蛋白发挥抗病毒和免疫调节作用的功能域、作为自由基SAM酶家族成员发挥作用的机制有了新的认识，但对Viperin能够在不同病毒感染细胞内发挥广泛作用确实切机制仍不是很清楚。论文就Viperin的基本生物学特性、发挥不同抗病毒机制的研究进展进行综述。 本文关键词语： 抗病毒蛋白; Viperin; 宿主细胞蛋白; 互相作用; Abstract： Viral infection of the cell is able to initiate a signaling cascade of events that ultimately attempts to limit viral replication and prevent escalating infection through expression of interferons and antiviral proteins.Viperin is an endoplasmic reticulum ER-associated protein that is relatively conserved among species and participates in innate immunity.It regulates signal transduction through interaction with viral proteins and certain intracellular proteins,and exerts a wide range of inhibition on proliferation of various viruses,which is spectrum antiviral effect.At present,there is a new understanding of the functional domain of Viperin protein that exerts antiviral and immunomodulatory effects,and the mechanism of function as a member of the free radical SAM enzyme family,but the exact mechanism for Viperin to play a wide range of roles in different virus-infected cells is still unclear.This article reviewed the basic biological characteristics of Viperin and the research progress on different antiviral mechanisms. Keyword： antiviral protein; Viperin; host cell protein; interaction; 地球上大多数生物都生存在微生物环境中，周边环境中充斥着各种各样的细菌与病毒，因而生物机体需要拥有完善的系统化的防御机制来抵抗细菌与病毒的侵扰，免疫系统在机体的防御机制中起到了重要作用。当病毒感染机体后，它会利用宿主的新陈代谢机制来完成病毒本身的复制与组装，然后释放到其他细胞当中1。机体本身的免疫系统通常分为先天性免疫病和获得性免疫两种。尽管杀伤性T细胞和产生抗体的B细胞在一段时间后能够对病原体产生适应性反响，但是先天性免疫对病毒感染能够做出最快速的反响，它是机体抵抗病原体的第一道防线。 病毒感染细胞能够激发免疫信号级联反响，通过释放多种细胞因子，来限制病毒复制和防止感染的不断升级。干扰素作为重要的细胞因子之一，能结合细胞外表特异性受体，诱导各种干扰素刺激基因IFN-stimulated genes,ISG的表示出，它们大多数都具有抗病毒活性，因而又被称为先天性免疫因子2。Viperin(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated interferon inducible便是华而不实的一员，研究发现宿主抗病毒蛋白Viperin在这个经过中发挥重要作用，它不仅具有限制多种病毒感染的能力，还表现出对型干扰素分泌的调节作用及调节很多转录因子的结合位点3。Viperin似乎具有调节细胞内状态及干扰病毒蛋白，进而创造不利病毒复制的环境的能力4。本文对Viperin的生物学特性、亚细胞定位及表示出调控、其抗病作用等方面的研究进展进行综述。 1、先天性免疫与干扰素刺激基因 机体发生病毒感染时，细胞能够通过形式辨别受体PRRs辨别入侵的病毒，激活细胞内多条信号通路并释放多种细胞因子5。作为最为重要的细胞因子之一的干扰素interferon,IFN，在抗病毒反响中发挥着关键作用6。有3种类型的干扰素，分别为型干扰素IFN- 、 、 、ε、 、型干扰素IFN- 和型干扰素IFN- 1、 2、 3)7。在抗病毒免疫反响中，型干扰素是发挥作用的最主要干扰素，是病毒感染细胞，或者细胞受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等物质刺激后，细胞内本身分泌的具有广谱抗病毒活性的细胞因子5。 型IFN包括由白细胞产生的IFN- 、由成纤维细胞合成的IFN- 、胎盘细胞合成的IFN-ε8,9、角质构成细胞合成的IFN- 9、IFN- 由白细胞产生并表现出与IFN- 类似的活性9,IFN- 和IFN- 由T和B淋巴细胞合成并分泌，但它们的功能仍不清楚。当病毒、细菌、真菌及寄生虫感染人体后，细胞主要产生的型干扰素为IFN- 和IFN- 。 IFN- 和IFN- 在调节先天免疫反响中有重要作用，十分是调节巨噬细胞和树突细胞的功能9。除此之外，它们还影响适应性免疫应答，调节T淋巴细胞主要是CD4+T和CD8+T细胞的功能9，影响Th淋巴细胞分化以及Tc、NK和B细胞的活化。同时，型IFN还影响细胞凋亡并促进炎症反响的发生9。 通过激活与病毒复制周期互相蛋白基因的转录，IFN- 和IFN- 可在感染和未感染的细胞以及旁观者细胞中诱导抗病毒免疫来发挥多效性9。除此之外，IFN- 能够与IFN- 相互协调加强抗病毒效果，且其抗病毒活性强于IFN- 9。 当病毒入侵细胞后，会激活细胞内的多种信号通路，进而诱导干扰素的产生，型IFN产生后会与细胞外表的特异性受体结合，通过信号级联反响激活下游300多种干扰素刺激基因IFN-stimulated genes,ISG的转录10，华而不实有很多基因编码产物都被发现能够显着限制病毒的复制，介入到多种抗病毒经过中，包括病毒抗原的呈递、细胞凋亡以及病毒复制与组装11。这些具有抗病毒活性的干扰素刺激基因编码产物，又被称为先天性免疫因子，随着对宿主抗病毒反响机制的了解逐步增加，仍然有大量的干扰素刺激基因未被发现和研究12。当前只对小部分干扰素刺激基因有了相关研究报道，例如蛋白激酶R(PKR),GTP酶MX1抗黏病毒1，核糖核酸酶L(RNaseL),ISG15(IFN激活蛋白为15ku),IFIT干扰素诱导蛋白与tetratricopeptide重复、Viperin蛋白等2。 2、Viperin的生物学特性 Viperin全称为与内质网相关联的干扰素刺激的病毒抑制性蛋白，又称为RSAD2(radical SAM domain-containing 2或cig5(Cytomegalovirus inducible gene 5。1997年初次在人类巨细胞病毒感染原代包皮成纤维细胞中得到了2个转录分析结果升高的片段，将这2个片段分别命名为cig5和cig3313。2001年，从经过IFN- 诱导后的人巨噬细胞中克隆出一段cDNA序列，该段DNA序列包含一个由1 083个碱基组成的开放阅读框，通过与之前发现的cig5、cig33进行比对后，发现它们具有极高的同源性，被命名为Viperin14。Viperin作为干扰素刺激基因被发现，在鱼类、爬行动物及各种哺乳动物中广泛存在2。 Viperin基因含有1083个核苷酸，可编码361个氨基酸15，不同的物种间略有差异，整体保守性较高16。Viperin蛋白的大小约为42ku，大致由3个较为明显的构造域组成13。N端的 螺旋构造域、C末端的保守构造域以及中间的S-腺苷甲硫氨酸酶构造域SAM域图1。N端的1-42位氨基酸构成两亲性 螺旋构造，在14-42位氨基酸存在亮氨酸拉链构造，在不同物种中这一区域的序列差异性较大，能够定位于细胞的内质网endoplasmic reticulum,ER外表和脂滴lipid droplets上17。中间部分从71到182位氨基酸含有4个相对保守的模块M1、M2、M3、M4),M1模块中包含了保守的CxxxCxxC序列，能够与铁硫簇结合进而起到催化作用，为S-腺苷甲硫氨酸酶超家族，催化减少S-腺苷甲硫氨酸向5 脱氧腺苷的转化。因而Viperin还有一个名称为RSAD218。固然当前研究以为Viperin蛋白不具有特定的酶活性，但在Viperin发挥抗病毒功能时，如在对抗丙型肝炎病毒HCV和人巨细胞病毒HCMV的感染中，该模块具有重要作用7。高度保守的C末端构造域大约由218-361位的氨基酸构成，当前关于该构造域的研究较少13，已经知道其对于Viperin蛋白的二聚很重要，还可能介导底物与酶之间的辨别以及蛋白与蛋白之间的互作相关。例如，在361位的氨基酸色氨酸残基，被证明在抗HCV的感染当中是必要的2。 图1 Viperin蛋白构造图 Fig.1 The protein structure of Viperin 为了解不同物质间Viperin的同源性，将序列进行了比对，构建了系统进化树。物种的Viperin序列从GenBank获得，使用MEGA 5.0软件的邻接法产生无根系统树，用1 000次重复进行分析。结果表示清楚，人Viperin与猩猩Viperin(Pan troglodytes和Gorilla具有较高的氨基酸序列同源性，但与家禽Gallus gallus和Anas platyrhynchos和鱼类Danio rerio和Cyprinus carpio的同源性相对较低。猪Viperin与牛和绵羊有共同祖先图2。 3、Viperin的诱导表示出及亚细胞定位 Viperin通常在多种类型的正常健康细胞中较低水平本身表示出，但是在干扰素、双链DNA、双链RNA、脂多糖以及Poly(I:C刺激或者多种病毒的诱导下，Viperin的表示出水平会显着上升19。如此图3所示，Viperin的诱导表示出包括两条主要途径。仙台病毒、伪狂犬病病毒以及辛德毕斯病毒都能够诱导干扰素刺激基因的产生。它们在进入宿主细胞后，首先被形式辨别受体PRRs，如Toll样受体TLR3和TLR4，视黄酸诱导基因RIG-以及细胞溶质DNA传感器辨别，激活干扰素调节因子IRF3和IRF7，进而激活IFN- 的表示出，产生的IFN- 通过自分泌或者旁分泌途径结合到细胞外表的型干扰素受体，进而合成复合物ISGF3，结合到Viperin启动子上进而激活Viperin的表示出20。除此之外，还有一些病毒，例如水疱性口炎病毒、人巨细胞病毒，它们的病毒颗粒在进入细胞后，病毒的dsRNA会刺激RLRs，进而与线粒体抗病毒信号蛋白MAVS互相作用，进而激活IRF1和IRF3的产生，进而诱导Viperin的表示出19。 图2 不同物种Viperin的系统进化树 Fig.2 Viperin phylogenetic tree of a range of species 图3 Viperin的诱导表示出途径 Fig.3 Inducible expression pathway of Viperin 有报道指出，Viperin能够构成同源二聚体，过表示出之后会使内质网结晶化，构成格状构造并毁坏内质网本身的构造13。有人因而作出了一种假设模型，即Viperin通过C端构造域和N端的 螺旋构造域构成二聚体，介导内质网结晶化，构成一种独特的构造16。已有研究表示清楚，Viperin能够定位在脂滴上，脂滴是一种起源于内质网的细胞器，能够储存蛋白质和脂质，介入到蛋白质的降解和脂质的运输等经过当中。同时脂滴已经被证明是HCV和登革病毒DENV在细胞中的复制场所。Viperin N端的双亲性 螺旋构造能够帮助Viperin锚定到脂滴上13。 4 、Viperin的表示出调控 敲除掉Viperin基因的小鼠影响了其免疫反响，表现为细胞受体介导的NF- B、AP-1的活性降低以及Th2反响的延迟。在其他使用人类单核树突细胞的研究中，发现Viperin在型树突细胞中的表示出水平比在型树突细胞中的更高层次，具有诱导原始T细胞向Th1和Th2细胞分化的能力。REIZIS B等报道了浆细胞样树突状细胞pDCs中Viperin在型干扰素的产生中扮演了重要角色。pDCs是起源于骨髓的免疫细胞，能够针对非本身核苷酸快速反响产生大量干扰素。pDCs有快速产生干扰素的能力主要是由于能够持续性表示出内源性的Toll样受体TLR7和TLR921。这2个受体分别能够辨别单链RNA和未甲基化的CpG DNA,IRF7则通过IRAK1和IKK 激活。与IRF1,IRF3一样，IRF7也属于干扰素转录调节因子家族。TLR7/9激活并结合到IRAK1和TRAF6后，Viperin能够被大量诱导表示出，该经过牵涉TLR信号通路。在pDCs中，Viperin的诱导对于经过TLR7/9产生型干扰素是必要的，Viperin基因缺失小鼠在TLR7/9刺激之后并不产生干扰素。Viperin蛋白N端的 螺旋对于型干扰素的产生很重要，不过并不与IRAK1和TRAF6相联合，表示清楚IRAK1和TRAF6的激活依靠于Viperin适宜的亚细胞定位。Viperin对于IRAK1和TRAF6在脂滴中的招募是重要的，随后才会激活IRF7。总之，在pDCs中，Viperin的诱导依靠于TLR7和TLR9信号通路，IRAK1和TRAF6又依靠Viperin招募到脂滴，之后IRF7被激活，进而诱导型干扰素的表示出22。 5、 Viperin的抗病毒作用 当前已有报道显示，Viperin在多种DNA病毒和RNA病毒中具有抗病毒功能，包括虫媒病毒丙型肝炎病毒HCV，西尼罗河病毒WNV，登革病毒DENV，甲病毒属辛德毕斯病毒，正黏病毒甲型流感病毒，副黏病毒仙台病毒，疱疹病毒人巨细胞病毒HCMV，棒状病毒水疱性口炎病毒VSV，逆转录病毒人类免疫缺陷病毒1型HIV-1等23。这些能够被Viperin拮抗的病毒种类繁多，各自存在着不同的增殖机制，所以很难系统概括Viperin的抗病毒机制表1。 表1 Viperin的抗病毒作用及关键构造域 将辛德毕斯病毒和Viperin蛋白同时皮下注射给新生小鼠，同时设置只注射病毒的新生小鼠的对照组，结果显示病毒的毒力出现了明显下降。另有数据显示，当将小鼠的viperin基因敲除掉后，小鼠会变得愈加容易感染西尼罗病毒；在干扰了viperin基因表示出的星形胶质细胞中，HIV-1的增殖水平明显上升24，表示清楚Viperin能够在中枢神经系统的先天性免疫反响中发挥其特有的功能。 在人类纤维母细胞中过表示出Viperin后，病毒蛋白Gb、pp28、pp65的表示出量明显下降，初次证明了Viperin在HCMV感染中具有抗病毒功能13。Viperin通过阻止病毒颗粒的释放来抑制甲型流感病毒和HIV-1的扩散。在HeLa细胞中过表示出人类或鼠类的Viperin都展现出了对病毒出芽的抑制效果。Viperin还被发现能够与法尼基二磷酸合酶FPPS结合，影响胆固醇和甾醇前体甲羟戊酸合成途径，进而毁坏了脂筏的构造，增加了膜的流动性。同时，在HEK293细胞中，Viperin能够利用它的SAM构造域抑制HIV-1的释放24。 Viperin能够抑制HCV的非构造蛋白NS5A的表示出，阻止其复合体在脂滴的构成，进而抑制HCV增殖25。Viperin的C端构造域能够与DENV的NS3蛋白结合互作，这一经过固然并不定位在脂滴上，但仍然能够发挥抑制病毒增殖的作用26。Viperin的SAM域的酶活性能够抑制TBEV的RNA的合成，进而起到对该病毒的抑制作用27。Viperin的 螺旋构造域不仅能抑制囊膜蛋白的表示出，毁坏内质网构造，阻碍病毒颗粒的组装，还能通过抑制马传染性贫血病毒EIAV受体的表示出，进而阻止病毒的入胞28。 总之，Viperin的广谱性抗病毒活性已被证实图4，在不同病毒感染中的作用靶点以及机制等仍需要进一步探寻求索。 图4 Viperin的部分抗病毒功能29 Fig.4 Partial antiviral functions of Viperin 6、 瞻望 根据生物进化的 红皇后假讲 ，Viperin在宿主与病毒的长期互相作用中，在哺乳动物和低等脊椎动物中高度保守，十分是Viperin的SAM构造域和C端在发挥抗病毒作用的同时，还表现出了高度保守性13，讲明在物种进化经过中，该蛋白在与多种病毒互相作用的压力下，仍然保持了其构造与功能的稳定性，能够揣测Viperin可能存在更多的潜在生物学功能。自2001年作为一种干扰素刺激基因被发现及其被鉴定为是对HCMV有效的宿主抗病毒蛋白以来，对于Viperin的生物化学和细胞生物学特性的了解正在逐步加深，但在很大程度上，它的精到准确作用机制仍然尚未定义。不同病毒在其复制周期中会采用不同的复制机制并利用不同的细胞器来完成复制，针对不同的病毒，Viperin会以不同的方式来抑制病毒的复制，同时它还具有调节先天性免疫信号的能力，但这华而不实仍然存在很多问题，例如Viperin在未感染细胞中能否具有其他功能？Viperin与内质网、脂滴或线粒体相关的生物学作用是什么？由于有很多病毒能够不通过产生干扰素而直接诱导Viperin的产生，因而能够揣测病毒能否会通过劫持Viperin来增加该病毒的感染性，针对这些问题的研究所获得的信息将有助于进一步说明Viperin的生化特性和抗病毒活性，这对于Viperin在抗病毒及先天性免疫中所扮演角色的认识具有重要意义。 以下为参考文献 1FENWICK M K,LI Y,CRESSWELL P,et al.Structural studies of viperin,an antiviral radical SAM enzymeJ.Proc Natl Acad Sci U S A,2021,114(26):6806-6811 2唐海波Viperin抑制狂犬病病毒机理的探寻求索研究D广西南宁：广西大学，2021 3袁玉康Viperin的泛素化及其蛋白水平的调控机制D江苏苏州：苏州大学，2021 4SEO J Y,YANEVA R,HINSON E R,et al.Human cytomegalovirus directly induces the antiviral protein viperin to enhance infectivityJ.Science,2018,332(6033):1093-1097 5BIOLATTI M,GUGLIESI F,DELLOSTE V,et al.Modulation of the innate immune response by human cytomegalovirusJ.Infect Genet Evol,2021,64:105-114 6LINDQVIST R,UPADHYAY A,OVERBY A K.Tick-borne flaviviruses and the typeinterferon responseJ.Viruses,2021,10(7):E340 7HONARMAND EBRAHIMI K.A unifying view of the broadspectrum antiviral activity of RSAD2(viperin)based on its radical-SAM chemistryJ.Metallomics,2021,10(4):539-552 8IVASHKIV L B,DONLIN L T.Regulation of type I interferon responsesJ.Nature Rev Immunol,2020,14(1):36-49 9DURBIN R K,KOTENKO S V,DURBIN J E.Interferon induction and function at the mucosal surfaceJ.Immunol Rev,2020,255(1):25-39 10FANG J,WANG H,BAI J,et al.Monkey Viperin restricts porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicationJ.PLoS One,2021,11(5):e0156513 11MCMAHON H T,GALLOP J L.Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodellingJ.Nature,2005,438(7068):590-596 12SCHNEIDER W M,CHEVILLOTTE M D,RICE C M.Interferon-stimulated genes:a complex web of host defensesJ.Annu Rev Immunol,2020,32:513-545 13朱春辉，汤艳东，徐方，等抗病毒免疫因子Viperin的研究进展J病毒学报，2021,31(1):91-96 14方剑玉，白娟，郭小参，等猪源Viperin蛋白抑制猪繁衍与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞J病毒学报，2021,33(2):216-223 15方剑玉，朱文豪，李海利，等猪源Viperin基因的克隆，原核表示出以及抗体的制备J华北农学报，2021(5):16-22 16孙立霈，陈舜，汪铭书，等干扰素刺激基因viperin所编码蛋白的构造与抗病毒功能的研究进展J中国预防兽医学报，2021,39(5):42242-42246 17LINDQVIST R,OVERBY A K.The role of Viperin in antiflavivirus responsesJ.DNA Cell Biol,2021,37(9):725-7230 18CHAKRAVARTI A,SELVADURAI K,SHAHOEI R,et al.Reconstitution and substrate specificity for isopentenyl pyrophosphate of the antiviral radical SAM enzyme viperinJ.JBiol Chem,2021,293(36):14122-14133 19王波，吴英，方玉莹，等病毒拟似物Poly(I:C诱导人卵巢颗粒细胞病毒反响蛋白viperin表示出J基础医学与临床，2021,38(8):1069-1073 20DUKHOVNY A,SHLOMAI A,SKLAN E H.The antiviral protein Viperin suppresses T7promoter dependent RNA synthesis-possible implications for its antiviral activityJ.Sci Rep,2021,8(1):8100 21REIZIS B,BUNIN A,GHOSH H S,et al.Plasmacytoid dendritic cells:recent progress and open questionsJ.Annu Rev Immunol,2018,29:163-183 22SAITOH T,SATOH T,YAMAMOTO N,et al.Antiviral protein Viperin promotes Toll-like receptor 7-and Toll-like receptor 9-mediated type I interferon production in plasmacytoid dendritic cellsJ.Immunity,2018,34(3):352-363 23方剑玉，朱文豪，郭小参，等表示出猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用J河南农业科学，2021,46(9):126-131 24NASR N,MADDOCKS S,TURVILLE S G,et al.HIV-1infection of human macrophages directly induces viperin which inhibits viral productionJ.Blood,2020,120(4):778-788 25WANG S,WU X,PAN T,et al.Viperin inhibits hepatitis Cvirus replication by interfering with binding of NS5Ato host protein hVAP-33J.J Gen Virol,2020,93(Pt 1):83-92 26HELBIG K J,CARR J M,CALVERT J K,et al.Viperin is induced following dengue virus type-2(DENV-2)infection and has anti-viral actions requiring the C-terminal end of viperinJ.PLoS Negl Trop Dis,2020,7(4):e2178 27李文良，毛立，邓加武，等抗病毒蛋白Viperin抑制猪瘟病毒在PK-15细胞上的复制J.2021,49(1):139-146 28TANG Y D,NA L,ZHU C H,et al.Equine viperin restricts equine infectious anemia virus replication by inhibiting the production and/or release of viral Gag,Env,and receptor via distortion of the endoplasmic reticulumJ.J Virol,2020,88(21):12296-122310.