口腔鳞状细胞癌采用沙利霉素的效果分析,口腔科学论文.docx

口腔鳞状细胞癌采用沙利霉素的效果分析,口腔科学论文摘 要： 目的：讨论沙利霉素salinomycin对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步讨论沙利霉素对信号通路的影响。方式方法：培养口腔鳞状细胞癌细胞系CAL-27，将1、2、4、8、16和32 mol/L沙利霉素和1.25、2.5、5、10、20、40和80 mol/L顺铂与CAL-27细胞共同培养，24h和48h后用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)法检测沙利霉素和顺铂对CAL-27细胞增殖的影响；0、2、4、8 mol/L沙利霉素和0、5、10、20 mol/L顺铂与CAL-27细胞共培养48h后，通过流式细胞术检测沙利霉素和顺铂对CAL-27细胞周期的影响，蛋白免疫印迹法Western blot检测CAL-27细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9cysteine-containing aspartate-specific proteases-9，Caspase-9,脱氧核糖核酸deoxyribonucleic acid，DNA修复酶poly ADP-ribose polymerase，PARP,蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)和磷酸化蛋白激酶B phosphorylated Protein Kinase B，p-Akt的表示出。结果：通过CCK-8试验表示清楚沙利霉素和顺铂均能显着抑制口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖且抑制作用呈时间依靠性和药物浓度依靠性，但是相对于临床一线化疗药物顺铂而言，沙利霉素对CAL-27细胞增殖的抑制效果愈加显着P0.001。细胞周期检测表示清楚与参加二甲基亚砜dimethyl sulfoxide，DMSO的对照组相比，8 mol/L沙利霉素与CAL-27细胞共同培养48h后，细胞休眠期/DNA合成前期的CAL-27细胞比例明显升高40.40% 1.99% vs.64.46% 0.90%，P0.05，DNA合成期和DNA合成后期/有丝分裂期的CAL-27细胞比例出现降低24.32% 2.30% vs.18.73% 0.61%，P0.05，35.01% 1.24% vs.16.54% 1.31%，P0.05；顺铂对CAL-27细胞周期没有特异性改变。蛋白免疫印迹法结果显示沙利霉素在上调CAL-27细胞中Caspase-3和 Caspase-9蛋白表示出P0.05的同时下调PARP、Akt和p-Akt蛋白的表示出P0.05。结论：相对于顺铂而言，沙利霉素对CAL-27细胞增殖有更强的抑制作用，并且能将口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞周期阻滞在细胞休眠期/DNA合成前期，同时能够诱导CAL-27细胞发生凋亡，这一机制可能和Akt/p-Akt信号通路相关。 本文关键词语： 沙利霉素; 口腔鳞状细胞癌; 细胞周期; 凋亡; Abstract： Objective: This study was aimed to investigate the effects of salinomycin on the proliferation and apoptosis of oral squamous carcinoma cells and to further understand the mechanisms of these effects. Methods: The human oral squamous carcinoma cell line CAL-27 was cultured in different concentrations of salinomycin and cisplatin. After co-culture with 0, 1, 2, 4, 8, 16 and 32 mol/L salinomycin or 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80 mol/L cisplatin for 24 hours and 48 hours, the proliferation of oral squamous carcinoma cells were detected by cell counting kit-8(CCK-8) assay. After exposed to 0, 2, 4, 8 mol/L salinomycin and 0, 5, 10, 20 mol/L cisplatin for 48 hours, the cell cycle of oral squamous carcinoma cells was detected by flow cytometry assay, and Western Blot analysis was performed to analyze the expression of cysteine-containing aspartate-specific proteases-3(Caspase-3), cysteine-containing aspartate-specific proteases-9(Caspase-9), poly ADP-ribose polymerase (PARP), protein kinase B (Akt) and phosphorylated Protein Kinase B (p-Akt) protein in oral squamous carcinoma cells. Results: Both salinomycin and cisplatin significantly inhibited the proliferation of oral squamous cell carcinoma CAL-27 cells in a time- and dose-dependent manner. However, compared with the first-line chemotherapeutic drug cisplatin, salinomycin showed stronger anti-proliferation activity in oral squamous carcinoma cells than cisplatin (P 0.001). After exposed to 8 mol/L salinomycin, CAL-27 cells exhibited markedly higher proportion in quiescent/ first gap phases (40.40% 1.99% vs. 64.46% 0.90%, P 0.05), and had a significantly lower proportion in synthesis phases and second gap / mitosis phases (24.32% 2.30% vs. 18.73% 0.61%, P 0.05; 35.01% 1.24% vs. 16.54% 1.31%, P 0.05) compared with the dimethyl sulfoxide control group; moreover cisplatin didn t show cell-cycle specific effect on CAL-27. Western blotting proved that salinomycin could up-regulate the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein in oral squamous cell carcinoma CAL-27 cells (P 0.05). At the same time, the level of PARP, Akt and p-Akt protein were down-regulated (P 0.05). Conclusion: Compared with cisplatin, salinomycin has a better inhibitory effect on the proliferation of oral squamous carcinoma cells and blocks the cell cycle process at the quiescent / first gap phase. At the same time, salinomycin could trigger apoptosis of oral squamous carcinoma cells and the mechanism is associated with the Akt/p-Akt signaling pathway. Keyword： Salinomycin; Oral squamous cell carcinoma; Cell cycle arrest; Apoptosis; 口腔癌是人类常见恶性肿瘤之一，每年有超过30万口腔癌新发病例，占全球新发肿瘤病例数的2.1%，口腔癌中超过90%是口腔鳞状细胞癌，占全球恶性肿瘤的1%2%1。当前，中国的口腔鳞状细胞癌发病率占恶性肿瘤总发病率的1.5%5.6%2。固然手术治疗结合术后放射治疗、化学治疗作为当前口腔鳞状细胞癌治疗的主要途径获得了较好的疗效，但是由于术后局部复发和远处转移，5年生存率仅为55%3。口腔鳞状细胞癌已经出现了耐药的现象，顺铂等一线化疗药物并不能全面遏制口腔鳞状细胞癌的发展4，因而寻找更高层次效的药物对抗口腔鳞状细胞癌的任务显得特别迫切。沙利霉素是1974年从白色链霉菌发酵液中分离出的一种羧基聚醚类钾离子载体抗生素，被广泛应用于防治家禽的球虫病，并在2018年初次发现沙利霉素能够选择性的杀死乳腺癌肿瘤干细胞，其效果比临床常用乳腺癌化疗药物紫杉醇高出100倍以上5。此后的研究表示清楚沙利霉素能够有效抑制卵巢癌6、鼻咽癌7、乳腺癌8和肺癌9等多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，但沙利霉素对于口腔鳞状细胞癌的作用尚不清楚。本研究旨在观察沙利霉素对口腔鳞状细胞癌的细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，并在分子水平初步讨论沙利霉素作用的机制。 1、 资料与方式方法 1.1、材料与试剂 沙利霉素溶于二甲基亚砜dimethyl sulfoxide，DMSO后，配置成所需浓度的溶液、顺铂和DMSO购于美国Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和磷酸缓冲盐溶液phosphate buffer saline，PBS购自美国Gibco公司; RPMI-1640培养基购于美国Hyclone公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、放射免疫沉淀分析radio immunoprecipitation assay，RIPA裂解液、蛋白浓度测定试剂盒(bicinchoninic acid，BCA)购自上海碧云天生物技术公司；细胞周期检测试剂盒购于上海七海生物公司；兔抗人多克隆抗体天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9cysteine-containing aspartate-specific proteases-9，Caspase-9、脱氧核糖核酸deoxyribonucleic acid，DNA修复酶poly ADP-ribose polymerase， PARP、蛋白激酶Bprotein kinase B，Akt和磷酸化蛋白激酶Bphosphorylated protein kinase B，p-Akt购自英国Abcam公司；二抗抗体购自北京索莱宝科技公司;人口腔鳞癌细胞系CAL-27购自美国形式培养物集存库。 1.2、细胞培养 人口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞复苏后，使用含10%体积分数胎牛血清的RMPI-1640培养基在37、5% CO2 体积分数的细胞培养箱中培养，每2天更换1次培养基。当细胞到达80%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。 1.3、CCK-8检测细胞增殖 取对数生长期CAL-27细胞，PBS洗涤后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，调节细胞浓度。以每孔5.0 103个细胞接种于96孔培养板中，每孔参加100 L培养液。24 h后PBS洗涤，沙利霉素实验组中分别参加1、2、4、8、16和32 mol/L的沙利霉素；顺铂实验组中分别参加1.25、2.5、5、10、20、40和80 mol/L的顺铂，另外设置无药物处理组为阴性对照，孔内不含药物和细胞的培养基为空白调零组，实验组、对照组、空白调零组均设置6个复孔。加药培养24 h和48 h后，吸弃培养基后每孔加10 L的CCK-8液继续培养；4 h后选择450 nm波长，用酶标仪(Thermo公司，美国)测定各孔光密度值，根据光密度值评估沙利霉素和顺铂处理后的细胞存活率。 1.4、流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的CAL-27细胞消化、计数，1 106/孔接种于六孔板中培养24 h后，沙利霉素实验组分别参加2、4和8 mol/L的沙利霉素，顺铂实验组分别参加5、10和20 mol/L的顺铂，对照组参加与实验组等量的培养基,培养48 h后,胰酶消化后收集细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加PBS洗涤细胞 2 次, 并用预冷的70%乙醇固定,4冰箱内过夜。分析前用PBS洗涤样本2次, 终浓度为50 mg/L的RNA酶及碘化丙啶，4避光孵育30 min后上机检测细胞周期的分布。 1.5、蛋白免疫印迹 将浓度为2、4和8 mol/L的沙利霉素和DMSO与CAL-27细胞共同培养48h后，弃培养液，参加RIPA裂解液后在冰上收集细胞，在4下离心12 000 r/min，10 min。利用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白质50 g进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，并用湿转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯poly(vinylidene fluoride)，PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2h后，将一抗Akt、p-Akt、Caspase-3、 Caspase-9和PARP1：1 000稀释4下孵育过夜。TBTS缓冲液tris buffered saline，with tween-20漂洗三次后参加二抗1：3 000稀释室温下孵育1h，参加加强荧光发光试剂显影，使用图像成像系统分析各条带。 1.6、统计学分析 数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据均以均数 标准差表示。组间生长抑制率的差异性比拟采用单因素方差分析，细胞周期变化以及蛋白表示出差异则通过Levene方差齐性检验组间的方差齐性，方差齐采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比拟采用 LSD-t法检验，P0.05被以为差异具有统计学意义。 2、结果 2.1、沙利霉素显着抑制口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖 通过CCK-8细胞增殖实验检测沙利霉素及顺铂对CAL-27细胞增殖的影响，发现顺铂和沙利霉素均对CAL-27细胞的增殖有明显的抑制作用图1A、B，且抑制作用呈现药物浓度和时间依靠的方式。沙利霉素处理24 h和48 h后，CAL-27的半抑制浓度half maximal inhibitory concentration，IC50值分别为7.98 0.42 mol/L和2.98 0.29 mol/L，明显低于顺铂处理组24 h和48 h的IC50值15.75 1.14 mol/L,6.57 0.32 mol/L，这些结果表示清楚，沙利霉素对CAL-27细胞的增殖抑制作用较顺铂更强P0.001。 图1 沙利霉素A和顺铂B对CAL-27细胞增殖的影响 下载原图 Figure 1 The anti-proliferation effects of salinomycin (A) and cisplatin (B) on CAL-27 cell lines 2.2、沙利霉素对CAL-27细胞周期的影响 对沙利霉素处理48 h的CAL-27细胞进行碘化丙啶染色，随后通过流式细胞仪检测细胞周期变化。如此图2 A所示，与对照组相比，沙利霉素处理组CAL-27细胞在DNA合成期和DNA合成后期/有丝分裂期比例明显减少，但在细胞休眠期/DNA合成前期比例显着增加40.40% 1.99%，52.72% 1.61%, 63.15% 1.63%和64.46% 0.90%，P0.05，这讲明CAL-27细胞以剂量依靠性方式诱导细胞休眠期/DNA合成前期细胞周期阻滞，但是4 mol/L和8 mol/L沙利霉素处理后，CAL-27细胞周期没有显着改变P 0.2。如此图2B所示，与对照组DNA合成期38.85% 0.99%相比，顺铂处理组在DNA合成期比例明显增加58.64% 2.59%，93.67% 1.03%，46.34% 3.22%，但是没有药物浓度依靠性。实验结果整体表示清楚顺铂对CAL-27各个细胞周期均有影响，不存在细胞周期特异性，并且无药物浓度依靠性。 图2 沙利霉素和顺铂对CAL-27细胞周期的影响 2.3、沙利霉素诱导口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞凋亡 对沙利霉素处理48h后的CAL-27细胞进行Western blot检测，图3中结果显示沙利霉素在上调口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞中Caspase-3和 Caspase-9蛋白表示出P0.05的同时能够下调PARP蛋白的表示出P0.05，这一结果表示清楚沙利霉素诱导CAL-27细胞凋亡，同时沙利霉素可以诱导DNA修复酶PARP裂解。为了解沙利霉素在CAL-27细胞凋亡中的分子基础，通过Western blot检测了Akt和p-Akt蛋白，结果显示4 mol/L和8 mol/L沙利霉素处理后Akt和p-Akt蛋白的表示出均降低，p-Akt蛋白更为显着P0.05。 图3 沙利霉素对CAL-27细胞凋亡以及凋亡信号通路的影响 3、讨论 本研究显示沙利霉素能够有效抑制口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖，且抑制作用呈现时间与药物浓度依靠性。与口腔癌临床一线化疗药物顺铂相比，沙利霉素对于口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖抑制作用愈加明显P0.001。为了进一步研究沙利霉素对于口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖抑制作用，本次研究对沙利霉素作用后的CAL-27细胞周期进行了检测，结果显示与对照组相比，沙利霉素处理组CAL-27细胞在DNA合成期和DNA合成后期/有丝分裂期比例明显减少，但在细胞休眠期/DNA合成前期比例显着增加，这讲明沙利霉素能将CAL-27细胞阻滞在细胞休眠期/DNA合成前期，这与Parajuli等10关于沙利霉素对卵巢癌的细胞周期阻滞结果相符。但我们的研究显示4 mol/L和8 mol/L沙利霉素处理后CAL-27细胞周期变化差异没有统计学意义，这表示清楚4 mol/L沙利霉素能够将CAL-27细胞阻滞在细胞休眠期/DNA合成前期，并且沙利霉素还有其他途径能够抑制CAL-27细胞增殖。同时本次研究对顺铂作用后的CAL-27细胞周期进行了检测，实验结果显示顺铂对CAL-27各个细胞周期均有影响，不存在细胞周期特异性，并且无药物浓度依靠性。通过回首文献，发现我们的结果与亓放等11在1999年提出顺铂为细胞周期非特异性化疗药物这一观点相符，并且与徐志巧等12于2020年主编的(实用肿瘤临床药物手册内描绘叙述顺铂为细胞周期非特异性药物的结论一致。凋亡是是抑制肿瘤生长的一个重要方式，钾离子在细胞凋亡的经过中扮演着特别重要的角色，而沙利霉素作为一种离子载体能够有效降低细胞间的钾离子水平13。回首既往文献发现，Nuutinen等14在2006年提出多种肿瘤内出现Akt通路的激活并在抑制凋亡中起到重要作用，另外Jeong等15于2008年在研究中提出活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9和Caspase-9均在细胞凋亡中起作用，并且Caspase9在诱导凋亡中作用愈加明显，所以本次实验通过Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的同时，检测与其相关的重要蛋白如PARP, Akt 和p-Akt进一步佐证沙利霉素诱导CAL-27细胞凋亡。实验结果发现沙利霉素作用于CAL-27细胞后，Caspase-3和Caspase-9蛋白表示出发生了上调，同时引起了DNA修复酶PARP的裂解，这提示沙利霉素能够诱导CAL-27细胞发生凋亡。另外本次实验发现沙利霉素能够降低Akt和p-Akt蛋白的表示出，且4 mol/L和8 mol/L沙利霉素对降低p-Akt蛋白表示出愈加显着，因而揣测沙利霉素诱导CAL-27细胞发生凋亡的机制可能与降低Akt和p-Akt蛋白表示出水平相关。 通常，我们希望化疗药物在能有效杀伤肿瘤细胞的同时能够对正常细胞产生较小或者不产生副作用。有报道表示清楚沙利霉素优先作用于肿瘤细胞而非正常细胞，Fuchs等13研究显示沙利霉素能诱导白血病CD4+T细胞凋亡，但对正常CD4+T淋巴细胞没有影响。Ketola16研究显示，较低剂量的沙利霉素如1 mol/L和1.33 mol/L对人前列腺癌细胞有着高效的抑制作用，但对正常前列腺细胞没有毒性作用。Kaplan等17的研究表示清楚，1 mol/L沙利霉素对卵巢上皮细胞没有毒性作用，但是这个浓度却能抑制卵巢癌细胞的增殖，这些研究表示清楚沙利霉素对肿瘤细胞具有高效的杀伤作用，但对正常细胞的毒性却很小。 综上所述，本实验证实沙利霉素能够有效抑制口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖，并且能将CAL-27细胞阻滞于细胞休眠期/ DNA合成前期，同时沙利霉素能够通过下调Akt和p-Akt蛋白表示出并激活Caspase-3和Caspase-9蛋白，促进DNA修复酶PARP的裂解来诱导CAL-27细胞的凋亡，这为今后口腔鳞状细胞癌的治疗提供了新的思路。 以下为参考文献 1 Ferlay J, Soerjomataram1 I, Dikshit R，et al. 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