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前列腺癌DNA异常甲基化的最新研究成果,医学遗传学论文前列腺癌是老年男性最常见的恶性肿瘤之一。当前，前列腺癌已成为中老年男性癌症发病的第 2 大病因，位居男性癌症致死人数的第 6 位。前列腺癌的发病机制较为复杂，当前以为遗传和表观遗传机制共同作用导致前列腺癌的发生、发展，华而不实表观遗传在前列腺癌的构成中起到重要的作用。表观遗传是指在染色体 DNA 序列不发生改变的情况下产生的一种可稳定遗传的表型。表观遗传机制包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰和 miRNA，它们分别通过转录前和转录后控制基因表示出，华而不实 DNA 甲基化在前列腺癌表观遗传机制研究中成果最多，也最为引人瞩目。在哺乳动物基因组中，DNA 甲基化通常发生在 CpG 双核苷酸的胞嘧啶上，由硫-腺苷-甲硫氨酸S-adenosylmethionine，SAM提供甲基供体，在 DNA 甲基转移酶DNA mthyltransferase，DNMT的催化下，将甲基转移到 CpG 双核苷酸胞嘧啶的第5 个碳原子上。CpG 不是随机分布的，它最常见于基因组 CpG 岛的位置，哺乳动物中一半以上的基因都含有 CpG 岛，大部分 CpG 岛位于基因启动子、非编码区和第一外显子，且在正常细胞内不发生甲基化。前列腺癌中 DNA 异常甲基化主要表现为基因组广泛低甲基化和局部基因启动子区域的高甲基化。DNA 异常甲基化发生在前列腺癌的构成经过中，且DNA 甲基化能够通过药物发生逆转，因而，前列腺癌 DNA 甲基化的早期筛查及前列腺癌去甲基化药物的临床应用，可能会为临床早期诊断和治疗前列腺癌提供新的思路。 本文主要阐述了前列腺癌表观遗传机制中DNA异常甲基化的最新研究成果以及前列腺癌 DNA 异常甲基化在临床转化中的应用及存在的问题。 1 DNA 高甲基化 基因组中 DNA 高甲基化常发生于基因的启动子区域，即富含 CpG 的 CpG 岛区域。这些区域在正常细胞中通常是非甲基化的。这些基因主要介入激素应答，细胞增殖、迁移和侵袭，DNA 修复及转录调控等表 1。基因启动子 DNA 高甲基化致使相关基因表示出沉默是前列腺肿瘤构成的一个重要原因。根据它们的功能和信号通路不同，主要包括下面相关基因： 1.1 激素应答相关基因 雄激素受体(Androgen receptor，AR)是类固醇激素受体家族的一个成员，与雄激素结合后与辅助蛋白分离进入细胞核内，刺激雄激素应答基因的转录。5-氮脱氧胞苷5-aza-CdR可逆转前列腺癌干细胞由 AR 基因启动子 DNA 高甲基化导致的表示出沉默，AR 表示出上调可降低前列腺癌干细胞特性，诱导癌细胞的增殖和分化。视黄酸受体 Retinoic acid receptorbeta，RARB是甲状腺类固醇激素受体家族成员之一，它与具有生物活性的维生素 A-视黄酸结合，介入细胞生长和分化及胚胎构成经过中的信号转导。RARB 基因启动子区域 DNA高甲基化可发生在多个肿瘤的构成经过中，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱癌、结直肠癌、恶性胶质瘤、鼻咽癌等。因而，我们推断该基因可能在多个肿瘤构成经过中介入调节肿瘤构成的共同传导途径。G 蛋白偶联受体Gprotein coupling receptors，GPCRs能够刺激 AR 的雄激素非依靠性激活，是导致激素难治性前列腺癌的发生的重要因素。G 蛋白信号调节因子 2 (Regulator of G-protein signaling 2，表 1 前列腺癌中启动子区域发生 DNA 高甲基化的基因RGS2)是一种 GTP 酶激活蛋白，能够抑制 GPCRs，介导骨髓细胞分化，可能介入白血病的构成。RGS2 基因启动子 DNA 高甲基化异常能够导致雄激素非依靠性前列腺癌细胞生长，表示清楚 RGS2 基因可能通过调控 GPCRs 介入 AR 反式激活通路。ATP 结合盒亚家族成员1(ATP-binding cassette, sub-family A，member 1，ABCA1)是存在于细胞膜外表的外流性转运蛋白，能够转运细胞内多余的胆固醇，在维持细胞胆固醇稳态方面起到重要作用。ABCA1基因启动子 DNA 高甲基化导致基因表示出沉默，它能使前列腺细胞内的胆固醇升高，雄激素合成增加，后者通过 AKT 信号通路促进前列腺癌的恶性进展。 1.2 抑癌基因 在前列腺癌 DNA 高甲基化研究中，最常见的是抑癌基因启动子 DNA 高甲基化。癌甲基化蛋白 1 (Hypermethylated in cancer 1，HIC1)基因表示出一种转录阻抑蛋白，在细胞中发挥生长调控和抑癌基因的作用。前列腺癌细胞系、前列腺组织和血浆中均发现 HIC1 基因启动子 DNA 高甲基化，在前列腺癌细胞异种移植的小鼠体内诱导表示出沉默的 HIC1 基因激活，能够观察到它具有抑制前列腺肿瘤生长、迁移和侵袭的作用。结肠腺瘤性息肉(Adenomatous polyposis coli，APC) 基因表示出一种 WNT 信号通路拮抗剂，它介入细胞的迁移、侵袭、转录激活和细胞凋亡，是一种常见的抑癌基因，该基因突变常导致家族性结肠腺瘤性息肉病。APC 基因启动子区域 DNA 高甲基化在前列腺患者组织中常见，且甲基化程度与前列腺癌肿瘤分期和 Glison 评分呈正相关。WNT 抑制因子 1 (WNT inhibitory factor 1,WIF1) 基因编码一种胞外信号分子，能够抑制 WNT 蛋白，介入胚胎发育。该基因启动子DNA 高甲基化发生在大多数前列腺癌细胞系中，体外诱导 PC-3 细胞系表示出 WIF1，可降低细胞迁移和侵袭能力，上调 E-钙粘素E-cadherin，CDH1、角蛋白-8,18Keratin-8 and-18，KRT8,18的表示出，进而抑制上皮细胞向间充质细胞转化。在异种移植小鼠模型发现 WIF1表示出升高能够抑制前列腺肿瘤生长。原钙粘附蛋白 10Protocadherin 10，PCDH10基因属于原钙黏蛋白家族成员，为抑癌基因，编码钙粘素相关蛋白受体，介入脑内特定细胞粘附及其功能联络，也介入前列腺癌的发生、发展。 1.3 信号转导基因 WNT 信号通路过度激活与肿瘤发生和肿瘤侵袭相关，分泌性卷曲相关蛋白 2Secretedfrizzled-related protein 2，SFRP2基因在 WNT 信号通路中能够抑制该信号通路过度激活。 SFRP2 基因启动子 DNA 高甲基化在前列腺癌组织中的发生率明显高于癌旁、高分级前列腺上皮内瘤和前列腺增生组织。Ras 相关域家族蛋白 1Ras association domain familymember1，RASSF1基因编码一种与 Ras 效应蛋白类似的蛋白，该基因启动子 DNA 高甲基化可在多个肿瘤组织中检测到，如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等，该基因同 RARB 基因一样，在肿瘤构成经过中介入其共同通路的调节。配对样同源域转录因子 2Paired-like homeodomain 2，PITX2基因表示出一种转录因子，调控原骨胶原赖氨酸羟化酶Procollagenlysyl hydroxylase基因的表示出，在促生长激素细胞和催乳素细胞的末端分化中发挥作用，同时也介入眼、牙齿和腹部器官的发育。在前列腺癌细胞系 P69 和 M12 中 PITX2 基因启动子区域均被甲基化，它可能作为 AR 和 IGF-1R 基因上游的调节因子，通过异常调节 AR 和 IGF1-R 通路，影响前列腺细胞的正常生长。胰岛素样生长因子蛋白 7Insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7能够与胰岛素生长因子Insulin-like growth factor，IGF结合，介入前列环素的合成及细胞粘附。IGFBP7 基因启动子 DNA 高甲基化在多种前列腺癌细胞系和组织中检测到，但当前其作用机制尚不清楚。 1.4 DNA 修复基因 谷胱甘肽 S-转移酶 1Glutathione S-transferase pi 1，GSTP1基因，属于谷胱甘肽 S-转移酶基因家族成员，它通过催化疏水性和亲电性基团与复原型谷胱甘肽结合发挥细胞解毒作用。在对 25 例行前列腺切除术的前列腺癌、癌旁基因甲基化水平评估后，发现 GSTP1 基因的甲基化水平在癌组织中明显高于癌旁组织。研究发现：前列腺癌细胞内 GSTP1 基因启动子 DNA 甲基化所致的表示出沉默使胞内活性氧物质ROS聚集，DNA 损伤标记物 胞内羟基脱氧鸟苷8-oxo-2 -deoxogunosine，8-OHdG增加，GSTP1 基因表示出缺失可增加正常前列腺细胞对氧化应激诱导的 DNA 损伤的敏感性，进而导致前列腺癌构成32。 1.5 miRNA miRNA 是内源性非编码的 RNA，能够与靶 mRNA 3 -UTRUntranslated region部分互补结合抑制其翻译或诱导特定的靶 mRNA 降解。前列腺癌中部分 miRNA 的异常调控也是由于表示出 miRNA 的基因启动子区域发生 DNA 高甲基化。在前列腺癌中启动子区域 DNA高甲基化导致 miR-31 表示出沉默，AR 表示出升高，可能是前列腺癌的恶性进展病因学机制之一33。miR-34b 和 miR-23b 都具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭，以及 EMT(上皮间质转化)的作用，miR-34b 和 miR-23b 基因高甲基化导致其表示出降低，原癌基因 Scr 激酶表示出升高，前列腺肿瘤细胞恶性增殖，导致患者复发生存期缩短。除此之外，miR-205、miR-29a、miR-1256、miR-124、miR-26a、miR-132、miR-145 基因高甲基化也介入前列腺癌构成。 1.6 其他 互作蛋白 1 样细丝蛋白 AFilaminAinteracting protein 1-like，FILIP1L基因表示出一种细胞血管内皮活性调控因子，FILIP1L 基因启动子高甲基化在前列腺癌中常见，可能与前列腺 癌 形 成 过 程 中 肿 瘤 血 管 的 形 成 相 关。 甲 基 胞 嘧 啶 双 加 氧 酶 TET1Tetmethylcytosinedioxygenase 1，TET1基因表示出介入胞嘧啶脱甲基的脱甲基酶。TET1 基因启动子 DNA 高甲基化，其 mRNA 表示出降低，能够下调金属蛋白酶抑制剂 1、2Tissueinhibitor of metalloproteinase 1 and 2，TIMP1、TIMP2表示出，进而促进前列腺癌转移、侵袭。死亡相关蛋白激酶 1Death-associated protein kinase1，DAPK1基因介入 干扰素INF- 诱导的程序性细胞凋亡。DAPK1 基因启动子区域 DNA 甲基化在前列腺癌组织中的发生率明显高于正常前列腺组织。泛素羧基末端水解酶 L1Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1，UCHL1基因介入泛素化经过，能够水解泛素羧基末端的甘氨酸，同时介入细胞增殖和分化。UCHL1 基因启动子 DNA 甲基化在前列腺癌组织中的发生率为 90%，癌旁组织为 15%，差异明显。除此之外，激肽释放酶 6、10Kallikrein-related peptidase 6,10，KLK6,10、DNA结合蛋白抑制因子 4Inhibitor of DNAbinding 4，ID4、锌指蛋白 132Zinc finger protein 132，ZNF132、A 型激酶铆钉蛋白 12A-kinase anchor protein 12，AKAP12、纤维蛋白样表皮生长因子细胞外基质蛋白 1EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1，EFEMP1等基因在前列腺癌细胞中也发生 DNA 高甲基化，可能通过其他途径介入前列腺癌的发生、发展，详细机制当前尚不清楚。 2、 DNA 低甲基化 尽管前列腺癌基因组中的部分基因启动子区域 DNA 常发生 CpG 高甲基化，但是在前列腺癌基因组中，CpG 位点低甲基化却占明显优势，在前列腺癌基因组内呈现广泛的低甲基化，而且 DNA 低甲基化并非随机的，这些 CpG 位点在正常前列腺组织中为低甲基化，它们常位于印记基因、逆转录转座子、内源性病毒序列、基因组的内含子、基因间区以及基因组中散在分布的重复序列或端粒的重复序列内。基因组中该位置的 CpG 位点低甲基化会导致印记基因过表示出、染色质构造改变、表观遗传重组及基因组不稳定，在前列腺癌的发病机制中同样发挥重要作用。当前对前列腺癌 DNA 低甲基化的研究相对较少，可能由于DNA 低甲基化通常发生在重复元件内，且 DNA 序列会有部分重叠，因而较难在实验中研究。 长散在核重复序列Long interspersed nuclear element1，LINE1为基因组内散在分布的重复序列，在正常细胞基因组内通常是高甲基化的。在前列腺癌样本中发生低甲基化，且更常见于转移性前列腺癌。除此之外，胰岛素样生长因子Insulin-like growth factor 2，IGF2基由于印记基因，其父源等位基因表示出相应蛋白，介入机体的生长和发育。IGF2 基因低甲基化导致两个等位基因同时表示出，前列腺癌中 IGF2 基因印记控制区尤其是 CTCF 结合域的甲基化水平与前列腺增生组织有显著性差异65, 66。三叶因子Trefoil factor，TFF基因在胃黏膜中表示出一种稳定的分泌性蛋白。前列腺癌细胞系中 TFF1、3 基因甲基化水平明显低于正常前列腺细胞，但它们在前列腺肿瘤的构成中的作用尚不清楚。 3 、DNA 甲基化的前列腺癌早期诊断 表观遗传标记物，尤其是 DNA 甲基化，可能会成为将来临床检测和诊断前列腺癌的新的方式方法和手段，主要由于表观遗传改变在前列腺癌中普遍存在，而且在前列腺肿瘤构成前期就已经发生，有利于临床早期筛查和检测。其次，相较于 RNA 检测来讲，基因组 DNA 的检测相对稳定，而且检测方式方法多样。再次，随着 DNA 甲基化检测技术的不断发展，标准化的高通量检测平台的建立能够用于多个样本 DNA 甲基化多个位点的检测，有利于临床开展DNA 甲基化检测。另外，DNA 甲基化作为标志物检测手段多样，不仅在肿瘤组织中检测，还能够在体液如尿液、血液中检测。 当前，很多研究致力于相关基因启动子 DNA 高甲基化作为前列腺癌生物标志物的临床检测。定量焦磷酸测序的方式方法对 52 例前列腺增生组织和 97 例前列腺癌组织中 APC 基因和GSTP1 基因两种 DNA 甲基化水平进行分析，发现区分前列腺癌和前列腺增生的敏感性为92.8%，特异性为 100%，在对 30 多个前列腺癌 GSTP1 基因启动子 DNA 高甲基化研究进行 Meta 分析，发现 GSTP1 基因启动子 DNA 甲基化检测能够提高临床前列腺癌诊断特异性69。APC 基因 DNA 甲基化检测能够作为初次活检阴性的前列腺癌高危人群再次活检的指标。对 34 例早期前列腺癌的患者的尿沉渣进行 DNA 甲基化分析发现，RARB 和 RASSF1 基因启动子 DNA 高甲基化的检出率分别为 71%和 44%。除此之外，联合检测 EVX1 和成纤维细胞生长因子 1Fibroblast growth factor 1，FGF1基因启动子 DNA 高甲基化可进一步鉴别出前列腺穿刺活检结果为阴性的前列腺癌患者，减少检查者不必要的痛苦，也能够降低检测成本和穿刺后并发症。 基因 DNA 甲基化检测作为临床前列腺癌的早期诊断，能够提高前列腺癌诊断特异性，为初次活检阴性的前列腺癌患者能否二次活检提供临床诊断参考。但前列腺癌 DNA 甲基化检测作为新的诊断方式方法也有需要待解决的问题：一是怎样选择前列腺癌特异性的 DNA 异常甲基化基因，有利于提高诊断特异性；二是怎样提高前列腺癌特异性的 DNA 异常甲基化基因检测的敏感性。 4 、DNA 甲基化对前列腺癌治疗 与常见的遗传改变不同，表观遗传学的改变不牵涉到 DNA 序列中碱基的改变。这种表观遗传学的可行性使它们有望成为潜在的药物治疗靶。当前主要的 DNMT 抑制剂分为两大类：核苷类似物和非核苷类似物。它们通过抑制 DNMT 来恢复相关基因的表示出功能，进而到达治疗前列腺癌的目的。前者主要有 5-氮杂胞苷、5-氮脱氧胞苷和 zebularineZeb，化学名 1- -D-呋喃核糖苷-1,2-二氢嘧啶-2-酮，前两种药物已经被美国 FDA 批准用于治疗骨髓异常增生综合征MDS。Zebularine 能够使 LNCaP 和 DU145 前列腺癌细胞系 GSTP1基因发生去甲基化，提高其他化疗药物的抗肿瘤活性。 后者主要包括从植物中提取化学物质如大豆异黄酮、姜黄素、茶多酚、mahanine、kazinol Q、disulfiram等，最新合成的甲基化抑制剂 RG108及其他化学物质如反式维甲酸等。大豆异黄酮能够抑制前列腺癌细胞系中的 DNMT，使多个基因启动子 DNA 发生去甲基化，抑制前列腺癌细胞生长和侵袭的作用。在 TRAMP 小鼠前列腺癌表观遗传学的研究中发现，姜黄素能够使启动子高甲基化的 Nrf2 基因发生去甲基化。全反式维甲酸能够使 R 阴性的前列腺细胞系 DU145 中表示出沉默的 HOXB13 基因的甲基化水平降低，进而抑制细胞增殖81。 上述 DNMT 抑制剂在前列腺癌甲基化的研究中主要应用于细胞系，之所以没有应用于临床，一是当前体外研究结果还未对 DNMT 抑制剂在抑制前列腺癌 DNA 高甲基化方面提供一个可靠且公认的生物学机制；二是当前还没有一种 DNMT 抑制剂为靶向治疗，DNMT抑制剂的应用可能会干扰正常组织及细胞功能，这种长期作用的结果是未知的；三是在临床前期实验中，这些药物对实体肿瘤细胞的细胞毒性较大及反响率较低，存在的药物副作用远远大于药物的治疗作用，因而限制了 DNMT 抑制剂在前列腺癌临床治疗中的应用。 5 DNA 甲基化对前列腺癌的预后评估DNA 甲基化检测对前列腺癌经临床治疗后疾病的预后预测也同样重要。对 267 例根治性前列腺癌切除术患者和 111 例前列腺癌保守治疗患者组织 APN 基因启动子区域甲基化分析、免疫组化分析及随访研究发现，APN 基因启动子区域高甲基化明显缩短前列腺癌患者的复发生存期和肿瘤生存期。经根治性前列腺癌切除术患者通过使用 RT-PCR 方式方法检测PIX2 基因高甲基化，能够预测前列腺癌患者 PSA 复发，是一个潜在的前列腺癌预后标志物82。低 Gleason 评分患者中 HSPB1 基因甲基化能够作为不良预后的生物标志物61。除此之外，术前 PSA 水平低的前列腺癌患者 miR-205 基因启动子高甲基化可能与 PSA 复发相关36。EVX1 基因在前列腺癌中能够预测 PSA 复发55。 6、 结束语与瞻望. 表观遗传改变，尤其是基因启动子区域的 DNA 高甲基化是前列腺癌的常见特征，在前列腺癌的发生和发病机制的进展中起到重要作用。但是，前列腺癌 DNA 异常甲基化研究还存在很多问题。第一，大部分研究只是针对前列腺癌中某个特定基因启动子区域中的一个或几个 CpG 位点进行甲基化分析，整个基因启动子区域的甲基化水平研究不够充分；第二，现存的技术手段很难对前列腺癌 DNA 异常甲基化进行精到准确的定量研究；第三，需要更多的前列腺癌组织样本进行大样本的重复验证；第四，表观遗传中 DNA 甲基化、组蛋白修饰及miRNA 三者在癌症的发生、发展中是互相作用的，因而需要更多更广泛的研究全面的阐述前列腺癌表观遗传机制；除此之外，遗传和表观遗传共同作用导致前列腺癌的发生，因而，怎样将遗传和表观遗传结合起来共同解释前列腺癌发病机制也是前列腺癌研究需解决的一个问题。 随着科学技术及研究水平的不断提高，我们相信通过获得大量的前列腺肿瘤特异性的遗传和表观遗传学改变，尤其是前列腺癌 DNA 甲基化的改变，进而对前列腺癌的发病机制进行更全面的阐述，并以此作为生物学标志物，可能会为前列腺癌的临床早期检测、诊断、预后评估及随访提供新的方式方法和手段。