胆汁酸稳态调节的选择性剪接研究,人体生理学论文.docx

胆汁酸稳态调节的选择性剪接研究,人体生理学论文一、胆汁酸的合成与转运 胆汁酸是胆固醇代谢的主要产物，胆汁的主要成分，调节多个生物经过，包括刺激肝脏胆汁分泌和促进小肠吸收脂肪及脂溶性维生素。胆汁酸可以通过激活特异性的受体和信号通路调节甘油三酯、胆固醇和葡萄糖的稳态平衡。 肝脏是合成胆汁酸的唯一器官。90% 95% 的胆汁酸直接由肝细胞内的胆固醇代谢产生。合成途径包 括 胆 固 醇 7 -羟 化 酶 cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1 介导的经典途径和类固醇 27羟化酶 sterol 27-hydroxylase,CYP27A1 介导的替代途径两种。 肠道内的胆汁酸仅 5% 由粪便排出，95% 在回肠末端被重吸收入血进行肠-肝循环。华而不实结合胆汁酸的重吸收与转运经过由两个转运蛋白超家族协同完成 图 1,表 1 : 溶质载体 solute carrier,SLC超家族介导入细胞经过，不消耗 ATP; ATP 结合盒 ATP-bingding cassette,ABC 转运体超家族介导出细胞经过，消耗 ATP1.牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸 taurine and glycin conjugated bile acids,T/G-BA ,在回肠的重吸收主要由顶侧膜的顶膜钠依靠性胆汁酸转运体 apical sodium dependent bile acidtransporter,ASBT SLC10A2 和基底膜的有机溶质转运体 organic solute transporter alpha-beta,OST -OST SLC51A-SLC51B 协同完成2.而细胞内运输由回肠脂质结合蛋白 ileal lipid binding pro-tein,ILBP 与胆汁酸结合。胆汁酸随门静脉血流运回肝脏，经肝细胞窦状隙膜的钠-牛磺胆酸共转运多肽 Na-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP SLC10A1 进入肝细胞，再与新合成的结合胆汁酸一起由肝细胞胆小管膜的胆盐输出泵 bile salt ex-port pump,BSEP ABCB11 分泌入胆道系统。 除了占大多数的 T/G-BA,少量硫酸盐或葡萄糖醛酸结合胆汁酸 sulfate and glucuronide conjuga-ted bile acid,S / U-BA 由肠上皮细胞基底膜的多药耐药相关蛋白-3 multidrug resistance-associated pro-tein-3,MRP3 ABCC3 泵入门静脉系统，再由肝细胞胆小管膜的 MRP2 ABCC2 分泌入胆道系统 图 1,表 1 .肠上皮细胞顶侧膜的 MRP2 将结合胆汁酸运回肠腔。少量羟基化胆汁酸 hydroxylatedbile acid,H-BA 由肝细胞胆小管膜的多药耐药蛋白-1 multidrug resistance protein 1, MDR1 ABCB1 分泌入胆道系统。游离胆汁酸在小肠各部和大肠通过弥散作用被动重吸收，由肝细胞窦状隙膜的有机阴离子转运蛋白 1B1 organic aniontransport protein 1B1, OATP1B1 SLCO1B1 和OATP1B3 SLCO1B3 摄入肝细胞2. 部分胆汁酸不经肝脏过滤进入体循环，但在肾脏经肾小球滤过后被近球小管的 ASBT 和 OST -OST 重吸收回体循环，尿液排出的胆汁酸量极少。胆汁淤积时肝细胞窦状隙膜的 OST -OST 、MRP3和 MRP4 ABCC4 将各类结合及游离胆汁酸排入体循环，经尿液排出，具有一定的代偿意义。 二、胆汁酸稳态的调节 核受体 nuclear receptor,NR 超家族成员法尼酯衍 生 物 X 受 体 farnesoid X receptor,FXR NR1H4 作为转录因子，广泛介入胆汁酸稳态各环节的调节 表 1 .FXR 通常与视黄醛衍生物 X 受体 retinoid X receptor alpha,RXR NR2B1构成异二聚体 FXR/RXR ，被激活后与靶基因启动子区 FXR 反响元件 FXR response element,FXRE结合，直接上调 OST 、OST 、ILBP、BSEP、OATP1B1和 OATP1B3 等 基 因 的 转 录3,4. 而 FXR 对CYP7A1、ASBT 和 NTCP 等基因的转录具有抑制作用，主要由下面两条通路介导3,5: 1 FXR-SHP-LRH-1 通 路，华而不实小异二聚体伴侣 small het-erodimer partner,SHP NR0B2 是 FXR 的直接靶基因，被诱导上调后，作为转录抑制因子与肝受体同系物-1 liver receptor homolog-1,LRH-1 NR5A2结合，抑 制 LRH-1 的 转 录 激 活 作 用； 2 FXR-FGF15 /19 通路，成纤维细胞生长因子 15 /19 fibro-blast growth factor 15,FGF15小鼠，FGF19人被 FXR 诱导上调后分泌入门静脉，随血流与肝细胞外表的 FGF 受体4 FGF receptor 4,FGFR4 结合，激活下游信号通路抑制靶基因转录。CYP7A1 受FXR-SHP-LRH-1 和 FXR-FGF15 /19 两条通路的负反应抑制作用3.而 SHP、OST 和 OST Franken-berg 等。 2006 均遭到 FXR 激活和抑制作用的动态调节5,6.CYP7A1 的转录也受肝 X 受体 liver X re-ceptor alpha,LXR NR1H3 的直接上调5.胆固醇代谢合成胆汁酸的中间产物-氧化甾醇可激活 LXR ，对 CYP7A1 进行前馈调节； 而胆汁酸可激活 FXR,对 CYP7A1 进行负反应调节5.有趣的是LXR / RXR 与 FXR / RXR 均可直接上调 OST 、OST 、ILBP 及 OATP1B1 的表示出4,5,7. 三、选择性剪接的调节与功能 真核生物的构造基因中含有具有表示出活性的外显子，还含有无表示出活性的内含子。转录时，外显子及内含子均转录到 mRNA 前体 pre-mRNA ,再通过剪接作用剪切掉内含子，连接外显子，得到成熟mRNA.而同一个 pre-mRNA 可通过不同的剪接方式产生不同的 mRNA,称为选择性剪接 或可变剪接 .哺乳动物体内编码蛋白质的基因数目与线虫和拟南芥近似，与生物体和细胞的复杂性严重不符。 而选择性剪接是增加真核生物多样性的重要机制之一。有 研 究 认 为94 % 的 人 类 基 因 具 有 选 择 性剪接8.剪接经过由剪接体 spliceosome 催化，它是由五个含有小核 RNA small nuclear RNA,snRNA 的小核核糖核蛋白 small nuclear Ribonucleoprotein,snRNP 及其他非 snRNP 蛋白质组成的大分子核酸蛋白复合物。剪接体辨别内含子中的 5 剪接位点、3 剪接位点及分支位点，完成内含子的切除和外显子的连接。剪接位点的辨别遭到多个顺式调控元件与反式调控因子的控制，顺式调控元件包括外显子剪接加强子 exon splicing enhancer,ESE 、外显子剪接沉默子 exon splicing silencer,ESS 、内含子剪接加强子 intron splicing enhancer,ISE 和内含子剪接沉默子 intron splicing silencer,ISS .剪接调控因子主要包括富含丝氨酸 serine,S 和精氨酸 ar-ginine,R 构造域的 SR 蛋白 SR protein 和核不均一核糖核蛋白 heterogeneous nuclear Ribonucleo-protein,hnRNP .SR 蛋白主要与剪接加强子结合，提高相邻剪接位点的活性。hnRNP 主要与剪接沉默子结合，抑制相邻剪接位点的活性。 兴奋性与抑制性剪接调控因子的相对浓度、磷酸化状态、pre-mRNA 的二级构造均会影响剪接位点的选择。而 microRNA miRNA 通过对剪接调控因子 mRNA 降解或翻译抑制，间接影响选择性剪接。由于 RNA 转录与剪接在空间和时间上严密偶联，转录延伸的速率 即 RNA 聚合酶 II 的移动速率 不同可影响强、弱剪接位点的辨别，延伸的速率减慢促进弱剪接位点的辨别，导致选择性外显子的纳入。染色质构型、核小体定位、组蛋白修饰和DNA 甲基化可通过影响蛋白招募，或改变 RNA 聚合酶 II 的移动速率影响选择性剪接18. 由选择性剪接产生的转录变异体通常具有组织分布或发育阶段特异性。转录变异体的构造变化通常分为三类： 1 选择性剪接使 mRNA 产生提早终止密码子 premature termination codon,PTC ,引起无 意 义 介 导 的 降 解 nonsense-mediated decay,NMD ,为真核生物控制 mRNA 质量的重要措施； 2 5 或 3 非翻译区的改变，影响 mRNA 的稳定性或翻译，甚至第一外显子的改变伴有启动子改变，产生不同的转录调节形式； 3 蛋白构造改变，影响蛋白的亚细胞定位与功能19.选择性剪接改变蛋白构造详细包括： 1 通过改变定位信号、翻译后修饰序列或与其他蛋白的互相作用位点而改变蛋白的亚细胞定位。亚细胞定位的改变也常伴有功能改变，尤其是膜结合型受体，其分泌型剪接变异体分泌入血会显着抑制正常的信号传导。2 改变细胞的生命进程，选择性外显子的纳入或跳过，引起剪接变异体促凋亡/抗凋亡、增殖/抗增殖特性转换，影响血管新生，与肿瘤发育密切相关。3 对转录因子的影响，选择性剪接改变反式激活构造域可影响 RNA 聚合酶 II 的活化，删除 DNA 结合域则导致与靶基因启动子结合能力丧失，转录因子可能无活性，可以能取代正常转录因子而产生显性失活作用。4 影响酶的底物特异性或活性，通常使酶活性降低或丧失，但某些激酶的本身抑制作用被选择性剪接改变，也会产生组成性活化的激酶。5 影响离子通道的开放时间、开放电压、离子特异性及对配体的反响性等各个方面19. 四、胆汁酸稳态调节的选择性剪接 一 FXR 核受体 FXR NR1H4 有四种剪接变异体 FXR 1、FXR 2、FXR 1 和 FXR 2.FXR 和 FXR 具有不同的氨基端，而 FXR 1 和 FXR 1在邻近 DNA 结合域的铰链区多 4 个氨基酸残基 a-mino acid residue,aa 的插入片断，导致其与靶基因启动子 FXRE 结合的亲和力降低。四种剪接变异体的组织表示出分布不同，除了全部在肝脏高表示出，FXR 1 与和 FXR 2 在回肠高表示出，在肾脏中度表示出，在胃、十二指肠和空肠低表示出 1 与 2 各占50% ; 而 FXR 1 与 FXR 2 在回肠和肾上腺中度表示出 1 与 2 各占 50% .四种变异体对靶基因的转录激活能力也存在差异，其激活 SHP 和 BSEP 的能力相当，而激活 ILBP 的能力 FXR 2 FXR 2 FXR 1 = FXR 1,最大差异超过 20 倍9.在FXR 全身敲除小鼠的肝脏特异性过表示出 FXR 2 或FXR 2,均可极大程度纠正 FXR 敲除所致的肝脏基因表示出谱改变，但在降低已升高的 HDL 水平、转录抑制类固醇 12 羟化酶 sterol 12 -hydroxylase,CYP8B1 的肝表示出、增加胆汁池亲水性、促进中性甾醇经小肠排入粪便等方面，FXR 2 的作用强于FXR 2. 二 FGFR4 成纤维细胞生长因子受体 FG-FR4 被 FGF15 /19 激活后介导 FXR 的负调节通路。FGFR4 基因包含 18 个外显子，蛋白为一次跨膜的受体型酪氨酸蛋白激酶，有 3 个细胞外免疫球蛋白 immunoglobulin,Ig 样构造域。华而不实外显子 1 不翻译，外显子 2 编码信号肽，外显子 3 编码第 1 个 Ig样构造域，外显子 4 编码酸盒 acid box ,外显子 5和 6 编码第 2 个 Ig 样构造域，外显子 7 和 8 编码第3 个 Ig 样构造域，外显子 9 编码跨膜区，外显子 10-12; 14-17 编码激酶构造域。在人乳癌细胞系发现一种可溶性 FGFR4 soluble FGFR4,sFGFR4 ,由于内含子 4 的保存，产生提早终止密码子，sFGFR4 分泌到细胞外，可抑制 FGF-1 介导的信号传导。而在人的胃肠道上皮细胞发现另一种可溶性 svFGFR4,编码跨膜区的外显子 9 被内含子 9 取代，蛋白分泌到细胞外。在小鼠发现两种 FGFR4 剪接变异体FGFR4-17a 和 FGFR4-17b,分别纳入内含子 17 的部分和全长序列，揣测蛋白质缺少羧基端细胞内尾。小鼠生肌细胞中的 FGFR4 -16 缺少外显子 16,缺失激酶构造域。而人垂体瘤来源的 FGFR4 pituita-ry tumor-derived FGFR4,ptd-FGFR4 mRNA 序列从外显子 5 开场，编码蛋白缺乏氨基端的信号肽和前两个 Ig 样构造域，蛋白定位于细胞浆，并且组成性磷酸化10. 三 RXR 核受体 RXR NR2B1 在小鼠睾丸发现 2 个剪接变异体 mRXR 2 和 mRXR 3,分别用了不同的选择性外显子 1b 和 1c,而外显子 2及之后的序列与原有主要亚型 mRXR 1 一样。mRXR 2 和 mRXR 3 编码一样的蛋白，与 mRXR 1相比缺少氨基端的 28aa,转录激活功能域 1 activa-tion function-1, AF-1 受 影 响。 mRXR 2 和mRXR 3 仅表示出于睾丸，在青春期高表示出，可能在生精经过起作用。随后在人也发现 2 个剪接变异体hRXR 2 和 hRXR 3,hRXR 2 与 原 有 主 要 亚 型hRXR 1 共用外显子 2 及之后的序列，编码蛋白缺少氨基端的 27aa,hRXR 3 与 hRXR 1 共用外显子3 及之后的序列，编码蛋白缺少氨基端的 97aa.hRXR 3 表示出于脑、脾和前列腺，而 hRXR 2 表示出水平过低检测不到。hRXR 2 和 hRXR 3 具 有 与hRXR 1 类似的转录活性和对配体的剂量反响曲线，但参加共激活因子后剂量反响曲线出现差异11. 四 LXR 核受体 LXR NR1H3 已在人发现 4 个剪接变异体 hLXR 2、hLXR 3、hLXR 4、hLXR 5.hLXR 2 应用选择性外显子 1,伴有启动子改变，氨基端缺少 45aa,使转录活性减低，仅在睾丸高表示出。hLXR 3 的外显子 6 被跳过，导致配体结合区缺少 50aa,不能与配体结合，无转录活性。虽 然 hLXR 3 可 竞 争 性 抑 制 原 有 主 要 亚 型hLXR 1,但不具有显性失活作用，且 hLXR 3 在各组织低表示出。hLXR 4 因保存了内含子 6 的 192bp,配体结合区有 64aa 的插入片断，具有微弱的转录活性。LXR 3 和 LXR 4 在小鼠组织也有低水平表示出。hLXR 5 在外显子 7 和外显子 8 之间纳入了一个选择性外显子，含有终止密码子，导致羧基端序列缺失 91aa.hLXR 5 可与辅阻遏物互相作用，过表示出时抑制 hLXR 1 的转录活性12. 五 ASBT 顶膜钠依靠性胆汁酸转运体 ASBT. SLC10A2 为七次跨膜蛋白，由 384 个 aa 构成，氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内。已发现一个选择性剪接变异体 t-ASBT,由于外显子 2 的跳过引起移码，产生 154aa 的短亚型，仅保存氨基端的三个跨膜区。选择性剪接引起转运体的亚细胞定位和功能改变： ASBT 位于肠上皮细胞、胆管细胞和肾脏近球小管上皮细胞的顶侧膜，将管腔中的胆汁酸转运到细胞内； 而 t-ASBT 位于上皮细胞的基底膜，将细胞内的胆汁酸转运排出细胞。在胆管细胞 ASBT 与t-ASBT 均被负反应调节，而在肠上皮细胞二者均被正反应调节13.可见 ASBT 与 t-ASBT 位于细胞两侧，协同调节胆汁酸的转运。 六 NTCP 钠-牛磺胆酸共转运多肽 NTCP. SLC10A1 为七次跨膜蛋白，由 362 个 aa 构成，氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内。NTCP 位于肝细胞窦状隙膜，将门静脉血流中的胆汁酸转运到肝细胞内。已发现一个选择性剪接变异体 NTCP2,最后一个内含子的保存使终止密码子提早出现，蛋白的羧基端变短，共含 317aa.全长 NTCP 为低亲和力/高容量转运体，而短的剪接变异体 NTCP2 为高亲和力/低容量转运体14. 七 OATP1B3 位于肝细胞窦状隙膜的有机。阴离子转运蛋白 OATP1B3 SLCO1B3 摄取游离胆汁酸，仅表示出于肝脏。而在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等癌组织发现了一种 OATP1B3 剪接变异体的广泛表示出，称为癌特异性 OATP1B3 cancer-specific OATP1B3, csOATP1B3 .csOATP1B3 的转录起始于选择性外显子 2a,缺少外显子 1 和 2,导 致 氨 基 酸 序 列 在 氨 基 端 缺 少28aa15.csOATP1B3 的亚细胞定位也显着改变，主要位于细胞浆，仅有少量转位到细胞膜。转录起始位点的改变伴有启动子改变，产生不同的转录调节形式16. 八 MRP4 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 MRP4 ABCC4 定位于肝细胞窦状隙膜，将肝细胞内的胆汁酸泵入体循环； 在肾脏定位于近球小管上皮细胞顶侧膜，将肾小管上皮细胞内的胆汁酸泵入管腔，促进胆汁酸由尿液排出。研究发如今人、猴和啮齿动物存在高度保守的 MRP4 选择性外显子 1a 和 1b,可组合构成 3 种选择性剪接变异体 V1、V2 和 V3,但均会构成提早终止密码子，引起无意义介导的降解17. 五、结束语与瞻望 选择性剪接是增加真核生物多样性的重要机制，影响着 mRNA 的转录调节与稳定性、蛋白质的细胞定位与功能。介入胆汁酸转运的多种转运体和调节胆汁酸稳态平衡的多种转录因子存在选择性剪接。选择性剪接已逐步成为研究热门之一。讨论剪接变异体的功能、内外环境刺激选择性剪接发生的机制与网络调节，对于深切进入研究机体生理功能及疾病的发生发展规律具有重要意义。 参 考 文 献 1 Klaassen CD,Aleksunes LM. Xenobiotic,bile acid,andcholesterol transporters: function and regulation. PharmacolRev,2018,621 96. 2 Dawson PA. Role of the intestinal bile acid transporters inbile acid and drug disposition. Handb Exp Pharmacol,2018,201169 203. 3 Matsubara T,Li F,Gonzalez FJ. FXR signaling in the en-terohepatic system. Mol Cell Endocrinol,2020,36817 29. 4 Meyer Zu Schwabedissen HE,Bottcher K,Chaudhry A,etal. Liver X receptor alpha and farnesoid X receptor are majortranscriptional regulators of OATP1B1. Hepatology,2018,521797 1807.