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多潜能干细胞应用于男性不育症的研究与前景,泌尿科论文精子携带遗传信息，并在父代与子代之间进行传递。精子发生初始，原始生殖细胞 primordialgerm cells,PGCs 从起源的尿囊基底部移行到生殖脊。在原始性腺定植之后，PGCs 经历 DNA 去甲基化、染色体修饰及亲代印迹的消除等经过。进入青春期之后，男性原始生殖细胞经过完好的减数分裂经过，构成有功能的成熟精子。在精子发生的经过中，任何一个环节的错误均有可能导致男性不育或者其他病理情况的发生。然而，人类精子发生的分子机制仍存在大量未解之谜，一部分原因是由于无法在体外模拟人类精子发生的早期阶段。因而，体外精子发生模型的建立将促进我们深切进入了解精子发生经过，进而更好地理解不育症的发病机制，有助于男性不育症的临床治疗。 国内外研究人员尝试利用多种类型的干细胞来体外诱导精子发生，包括精原干细胞 spermatagonialstem cells,SSCs 、间充质干细胞 mesenchymal stemcells,MSCs 、胚胎干细胞 embryonic stem cells,ESCs ,以及新近出现的诱导多潜能干细胞 inducedpluripotent stem cells,iPSCs .华而不实，SSCs 与 MSCs均属于成体干细胞，是存在于已分化组织中的未分化细胞，常定位于特定的微环境中1.SSCs 是精子发生的基础，在尽可能模拟生精微环境的条件下，SSCs 比其他类型的干细胞更易诱导精子构成，但是SSCs 的分离纯化较为复杂，且对于本身缺乏 SSCs的不育患者，这一方案也无法施行。MSCs 广泛存在于多种组织中，易于体外扩增，常用的 MSCs 多来源于脐带与骨髓组织2.然而，研究表示清楚 MSCs 在向精子诱导分化的经过中，能够加强减数分裂相关基因的表示出，但是较难跨越减数分裂的瓶颈，可能与本身的分化潜能有关3.ESCs 是一种高度未分化的细胞，具有发育全能性，且已经实现体外诱导为具有生物活性的精子，但是人 ESCs 的制备面临伦理争议，因此相关研究遭到了一定程度的限制。 iPSCs 的出现成功避免了 ESCs 研究的相关争议。个体特异来源的 iPSCs 不会引起免疫排挤反响，且与供体细胞具有完全一样的遗传信息，更为重要的是 iPSCs 的建立不需要卵细胞，也无需毁坏胚胎发育，避免了伦理上的限制。因而，国内外研究者们不断在寻求诱导 iPSCs 向生殖细胞分化的方式方法。 本文将对 iPSCs 在精子发生经过中的相关研究进行综述，并讨论 iPSCs 应用于男性不育症临床治疗所面临的问题以及发展前景。 1 ESCs 诱导精子发生的研究现在状况 近年来，ESCs 诱导精子发生已经在众多物种中进行探寻求索，并获得了宏大的研究进展，尤其是小鼠和人 ESCs 体外向生殖细胞分化的大量研究。国外多个研究小组通过拟胚体 embryoid body,EB 构成，并经过 BMP4 bone morphogenetic pro-tein4,BMP4 或 RA retinoic acid,RA 诱导可使小鼠 ESCs 分化为各阶段雄性生殖细胞。Geijsen 等4证实了小鼠 ESCs 来源的单倍体细胞能够使卵子受精。Nayernia 等5更进一步利用小鼠 ESCs 来源的雄性生殖细胞获得了存活的后代，但是存活下来的子代小鼠体型均比对照组大或小，且不能存活超过6 个月，测序结果也表示清楚实验获得的配子并没有完全去除祖父代的甲基化印记，研究人员以为扰乱的雄性生殖细胞特异性甲基化印记是后代表型异常和成熟前死亡的原因。因而，更多的研究需要探寻求索ESCs 来源的生殖细胞与正常的生殖细胞之间甲基化印记的差异及发生机制。Hayashi 等6利用贴壁细胞两步分化法，通过一系列细胞因子的作用也使小鼠 ESCs 分化获得了原始生殖细胞样细胞 PGC-like cells,PGCLCs ,PGCLCs 来源的精子不仅能够使卵子受精，而且产生了存活的后代。 相比之下，人 ESCs hESCs 诱导精子发生的研究相比照较受限。研究表示清楚，hESCs 来源的 EBs 能够自发向雄性生殖细胞分化，表示出多种生殖细胞及单倍体细胞的分子标志物，包括 VASA、BOL、SCP1以及 SCP3 等7.Chen 等8也发现 hESCs 自发向生殖细胞分化。然而，这些研究都说明这种自发的分化效率非常低且不完全。单层细胞分化法、EB 分化法、新生性腺组织共培养法等均被用来研究hESCs 向 PGCs 的分化，但是众多的研究均没有跨越减数分裂的瓶颈。通过过表示出与精子发生相关的家族基因 DAZL、DAZ 及 BOULE ,Kee 等9实现了减数分裂并获得了单倍体细胞。一些研究小组在避免基因修饰的同时，也实现了 hESCs 向生殖细胞的分化。Eguizabal 等10的 3 步法固然在 hESCs 分化的细胞中检测到了减数分裂相关标志物的表示出，但并未获得单倍体细胞。其后，Easley 等11证实了在精原干细胞的培养条件下，hESCs 能够直接分化为单倍体细胞，但是效率很低。由于伦理限制，这些研究获得的生殖细胞并未进行功能探究。 ESCs 诱导分化的相关研究为体外研究精子发生的机制提供了方式方法参考，同时也为生殖细胞缺乏 如非梗阻性无精子症 的患者带来了希望。然而，ESCs 来源的生殖细胞与不育患者并不存在遗传学上的联络，而且，由于人 ESCs 的建立需要大量的卵细胞，牵涉毁坏发育中的囊胚，这些问题所牵涉的伦理学争议限制了 ESCs 的研究以及在临床上的应用。 2 iPSCs 技术的出现 2006 年，Takahashi 等12通过在分化的胎鼠成纤维细胞中表示出某些特定转录因子 Sox2,Oct4,Klf4,c-Myc ,可诱导体细胞的重编程而获得与 ESC类似的细胞，这些细胞可不断自我更新并具有发育多潜能性，因而被命名为 iPSCs.在建立小鼠 iPSCs后，应用类似的方式方法，研究者们也很快地建立了人iPSCs hiPSCs . 2007 年，Okita 等13已经证实了 iPSCs 能够在嵌合体小鼠中分化为生殖腺细胞。2018 年，中科院的研究小组初次利用 iPSCs,通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁衍能力的小鼠，在世界上第 1 次证明了 iPSCs 的全能性14,国内外科学家也相继证实了这一结论15-16. 3 iPSCs 诱导精子发生 hiPSCs 来源于患者的体细胞，建立相对简单，重复性好，不仅能够分化为供体的各种类型细胞，而且避免了免疫排挤及伦理问题，更合适于诱导分化为个体特异性的精子细胞。近年来，很多研究证实iPSCs 具有体外向男性生殖细胞分化的潜力。 2020 年，Zhu 等17在无 LIF 的培养液中培养小鼠 iPSCs 获得 EBs,并通过 RA 诱导其分化为表示出VASA、CDH1 和 GFRa1 的精原干细胞 spermatogo-nial stem cells,SSCs .他们进一步将这些 iPSCs 分化来的 SSCs 移植到白消安处理后生精损伤的小鼠睾丸组织中，这些细胞能够分化为各个阶段的雄性生殖细胞，包括精原细胞到圆形精子细胞，并表示出VASA 和 SCP3.Li 等18和 Niu 等19也通过 EBs 构成及 RA 或睾酮诱导的方式方法获得了类似的结果。这些研究均证实了小鼠 iPSCs 有分化为晚期雄性生殖细胞的潜力，但是精母细胞标志物联会复合体蛋白3 SCP3 的表示出并没有增加，讲明这些诱导方式方法并没有使 iPSCs 体外分化为精母细胞。 2020 年，在 Hayashi 等6的研究基础上，Li等20更为有效地将小鼠 iPSCs 诱导分化为 PGCs 样的细胞，他们首先诱导 iPSCs 分化为上胚层样细胞 induced epiblast-like cells,iEpiLCs ,在促进分化的特定培养液中培养 1 6 d,通过流式分选出Stra8-EGFP 阳性的 PGCs 样细胞 induced PGC-likecells,iPGCLCs ,最终通过 RA 及 BMP4 的诱导作用，获得生殖干细胞样的细胞 germline stem cell-like cells,iGSCLCs .同年，Cai 等21也报道通过RA 诱导使小鼠 iPSCs 体外分化为 PGCs 样的细胞，他们还将小鼠 iPSCs 与新生小鼠的睾丸组织细胞悬液共同移植到雄性裸鼠的背部，研究者定期利用活细胞成像系统检测移植物的构造，发现移植部位有生精小管的重建，并且 iPSCs 出现了归巢和分化。 2020 年，大部分研究逐步集中于人特异性疾病来源的 iPSCs,研究者们相继获得各种不育男性体细胞来源的 iPSCs,包括 AZF 缺失、染色体异常等原因所致的不育。鉴于 hiPSCs 的体内研究受伦理限制，研究也主要限于异种移植于小鼠体内。 与 hESCs 相比，hiPSCs 的优势使其更便于进行精子发生的相关研究。2018 年，Park 等22将 hiPS-Cs 与胎儿性腺基质细胞共培养，第 1 次证实了 hiP-SCs 能够向 PGCs 样的细胞分化。他们从胎儿性腺组织中提取滋养层细胞，将 hiPSCs 与滋养层细胞共培养，培养第 7 d 观察到出现约 8% 10% 的 PGCs hiPS-PGCs ,进而证实了 hiPSCs 体外向生殖细胞分化的能力； 在 PGCs 构成的经过中，他们检测了 3个印记基因 PEG1、H19 和 SNRPN 的甲基化水平，发现 hiPS-PGCs 印记消除率与 hESCs 有所不同。 2018 年，Panula 等23发现胎儿和成人体细胞来源的 hiPSCs 与 hESCs 类似，能够分化为 PGCs.过表示出 DAZ 家族蛋白时，分化所得的生殖细胞能够进入减数分裂阶段，并可获得表示出顶体蛋白的单倍体细胞。他们还发现 iPSCs 比 hESCs 更易自发向生殖细胞分化，这可能与细胞重编程经过中多能性基因的加强表示出有关。 另外一些研究小组通过改变基因表示出水平来促进 hiPSCs 向男性生殖细胞进一步分化。Medrano等24已经证实过表示出一些 RAN 结合蛋白如 VASA、DAZL,能够促进 hiPSCs 分化所得的生殖细胞进入减数分裂阶段。Eguizabal 等10初次实现了 hiPSC向减数分裂后细胞的分化。他们设计了三步分化法，首先用不含 bFGF 的 ESC 培养 hiPSCs 3 周，然后参加 RA 继续培养 3 周，分选出 CD9+、CD49f+、CD90-、SSEA4-的细胞，继续在含有 Forskolin、LIF、bFGF 及 R115866 CYP26 抑制剂 的条件培养液中培养 4 周，最终获得了各阶段的男性生殖细胞，分别表示出精原细胞、减数分裂前精母细胞、减数分裂后精母细胞和圆形精子细胞的标志物，但是，尚需要进一步的研究确定所得的圆形精子细胞能否具有使卵子受精构成胚胎的能力。更为值得注意的是，不经过基因修饰，Easley 等11直接在标准的小鼠精原干细胞的培养条件下，使 hiPSCs 分化为单倍体生精细胞。 2020 年，Surani 和 Hanna 等证实 hiPSCs 能够体外分化为原始生殖细胞样细胞 hPGC-like cells,hPGCLCs ,并通过一系列实验发现 SOX17 基因是决定 PGCs 命运的标志物，对体外培养出成熟精子起关键作用25.Ramathal 等26将 hiPSCs 异种移植到生精损伤的小鼠睾丸微环境中，发现生育力正常男性来源的 hiPSCs 能够分化为生殖细胞样细胞 germ cell-like cells,GCLCs ,然而，Y 染色体 AZF区域缺失男性来源的 hiPSCs 在一样的环境中向生殖细胞分化的能力明显缺乏。该研究揭示了体细胞微环境与定植的干细胞间存在信息沟通，这种细胞间的对话可能是影响 hiPSCs 向生殖细胞分化的重要因素。该研究小组还在传统的 4 个转录因子 OSKM 基础上，添加了生殖细胞特异的转录因子VASA,利用 mRNA 介导重编程获得 OSKMV hiPS-Cs,他们发现异种移植到免疫缺陷的无精子症模型小鼠的生精小管后，OSKMV hiPSCs 向生殖细胞分化的能力与 OSKM hiPSCs 明显不同，前者更明显地向生殖细胞分化27.这些研究都可能促进我们对人类精子发生的遗传分析。 固然 iPSCs 诱导精子发生已经获得众多进展，但基础研究中仍有很多问题需要进一步探究。当前尚无研究报道 iPSCs 来源的精子细胞实现了运动功能，只要构造正常的精子才具有良好的运动功能和受精能力； 同时，也需要更多的研究来证实 iPSCs 能够经过整个减数分裂前期、减数分裂期及减数分裂后期的所有变化，进而完成整个精子发生的经过，并尽可能对分化所得的精子细胞进行功能鉴定。 4 iPSCs 应用于临床治疗所面临的问题 固然 iPSCs 能够诱导分化为生殖细胞，但将其应用于临床治疗仍面对宏大的挑战，如现有分化方案的效率较低，体外基因操作带来的遗传学、表观遗传学改变，iPSCs 本身可能带来的成瘤风险以及伦理道德方面的限制等。 iPSCs 的临床应用首先要解决安全问题。当前iPSCs 制备通常借助逆转录病毒为载体，将几种转录因子转入分化的体细胞，诱导其重编程为 iPSCs.这种方式方法可能由于外源基因插入细胞基因组，干扰内源基因的表示出，同时一些转录因子是致癌基因，可能诱发肿瘤。iPSCs 本身多能性也具有潜在危险性，如畸胎瘤的构成、异常重编程等。为解决病毒载体的安全问题，研究者们也进行了大量的探究，试图通过非病毒载体将多能性相关的基因带入体细胞中，进而实现体细胞的重编程。当前，已有的非病毒载体有质粒、PB 转座子 piggyBac transposition 、mRNA、蛋白质介导、microRNA、小分子化合物等。 华而不实，我们国家研究小组首先报道的利用小分子化合物实现体细胞向多能干细胞重编程，为 iPSCs 的制备提供了愈加简单和安全的方式方法，成为当前最为理想的诱导方式方法。他们对多种化合物组合进行优化挑选，最终利用 VC6TFZ VPA,CHIR99021,616452,Trany lcyprotamine,Forskolin,dznep 小分子化合物组合以及后期的 2i 培养液，实现了小鼠胚胎成纤维细胞的重编程，并将诱导而来的多能细胞命名为化合物诱导性多能干细胞 chemically induced pluri-potent stem cells,CiPSCs28. 其次，效率问题也是制约 iPSCs 由实验室走向临床的瓶颈之一，怎样提高 iPSCs 的制备效率也是人们普遍关注的问题。最新出现的蛋白质和 mRNA介导制备的 iPSCs 基本避免了插入突变和成瘤风险，但蛋白质介导的重编程效率很低，而 mRNA 介导的重编程效率较高29-31.同时，我们仍需要进行更为深切进入细致的表观遗传学研究，分析 iPSCs 基因表示出及表观遗传的完好性及特异性。 iPS 技术固然避免了毁坏发育中囊胚的伦理争议，但是并不代表其在道德层面不受质疑，尤其是应用于治疗男性不育症的领域。当前，正是由于伦理及法律限制，我们尚不能利用卵细胞胞质内单精子注射 ICSI 技术来证实人 iPSCs 体外分化所得的精子能否能够产生正常的后代。将来进行不育症患者特异性 iPSC 的制备以及临床治疗时，还要建立严格的操作流程及标准来规范组织取材经过，并且做到患者完全知情同意。 5 瞻望 越来越多的临床资料和流行病学证据表示清楚男性不育的发病率呈上升趋势32.ICSI 及睾丸穿刺取精技术 testicular sperm extraction,TESE 的成熟为非梗阻性无精子症患者提供了获得遗传学后代的时机，但是文献报道 TESE 的平均成功率仅49. 5%33,超过一半的患者 TESE 失败，他们该怎样获得遗传学上的后代，假如能够获得携带患者遗传信息的单倍体细胞，通过 ICSI 技术可能使其获得遗传学上的后代。iPSCs 向生殖细胞分化及在体移植的相关研究为无精子症的干细胞替代治疗提供了新的希望。 iPS 技术能够体外模拟疾病发生，揭示潜在致病机制，通过细胞水平的修正，为患者提供量身定制的细胞替代治疗。当前，已报道的疾病特异性 iPSCs多来自于有明确基因突变所致的疾病，而这些突变多以孟德尔方式遗传34.然而，大部分疾病的遗传背景是极为复杂的，可能是散发的，可以能是多个基因位点的多态性。在这种情况下，传统的转基因动物或基因修饰的细胞系已经不能知足对疾病发生的模拟。相比之下，iPS 技术具有明显的优势，疾病特异性的 iPSCs 能够来自具有不同表型的患者，即便这些疾病具有复杂的遗传学病因，例如 Y 染色体AZF 区域有缺失的不育患者以及一些病因不明的特发性无精子症患者。我们能够获得特发性无精子症患者特异的 iPSCs,在诱导其向男性生殖细胞分化的经过中，探寻其分化能力的异常或缺陷，为一些病因不明的患者提供更准确的治疗方式方法。更为有意义的是，利用 iPSCs 模拟精子发生的经过，很有可能促使人们更深切进入地了解人类精子发生的分子机制。 iPS 技术出现后的短短几年间，iPSCs 向男性生殖细胞分化的研究已经获得了突破性的进展，新建立 iPSCs 的方式方法也大大提高了其在临床应用上的安全性，进一步拉近了 iPSCs 与男性不育症治疗的距离。生殖细胞缺乏的男性患者能够通过本身体细胞来源的 iPSCs,诱导分化为携带本身遗传物质的生殖细胞，这为男性不育症的治疗提供了新的精子来源。 我们期望早日看到 iPSCs 应用于临床治疗，但是，精子作为遗传物质的携带者，从精子发生到受精以致胚胎发育的任何一个经过都不能出现错误过失，对构成的精子仍需要进行长期的质量评估。 以下为参考文献： 1 杨瑞峰，熊承良。 成体干细胞在男性不育领域的应用及瞻望。 中华男科学杂志，2020,19 5 : 468-471. 2 蔡益婷，熊承良。 间充质干细胞的生物学特性及在男性不育中的应用。 中华男科学杂志，2020,19 10 : 949-952.