特殊光学显微镜的原理与使用(精品).ppt

特殊光学特殊光学显微微镜的原理与使用的原理与使用暗暗视野显微镜视野显微镜相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜偏光显微镜偏光显微镜干涉显微镜干涉显微镜体视显微镜体视显微镜倒置显微镜倒置显微镜共聚焦显微镜共聚焦显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜。被检物体的显微镜。不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达质颗粒的存在与否。最高分辨率可达0.004um,”超显微超显微镜术镜术“1.换上暗视野聚光器并在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射向标本。2.将视场光圈适当缩小，用10倍物镜找到被检物体，同时可在视场中看到视场光圈的轮廓像。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈的像清晰可见。步骤步骤相差显微镜的相差显微镜的特点特点光光线线通通过过比比较较透透明明的的标标本本时时，光光的的波波长长（颜颜色色）和和振振幅幅（亮亮度度）都都没没有有明明显显的的变变化化。因因此此，用用普普通通光光学学显显微微镜镜观观察察未未经经染染色色的的标标本本（如如活活的的细细胞胞）时时，其其形形态和内部结构往往难以分辨。态和内部结构往往难以分辨。相相差差显显微微镜镜能能通通过过其其特特殊殊装装置置环环状状光光阑阑和和相相板板，利利用用光光的的干干涉涉现现象象，将将光光的的相相位位差差转转变变为为人人眼眼可可以以察察觉觉的的振振幅幅差差（明明暗暗差差），从从而而使使原原来来透透明明的的物物体体表表现现出出明明显显的的明明暗暗差差异异，对对比比度度增增强强，使使我我们们能能比比较较清清楚楚的的观观察察到到普普通通光光学学显显微微镜镜和和暗暗视视野野显显微微镜镜下下都都看看不不到到或或看看不不清清的活细胞及细胞内的某些细微结构的活细胞及细胞内的某些细微结构相差显微镜的相差显微镜的成像原理成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置1、环状光阑、环状光阑具有环形开孔的光阑。位于聚光器的具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。转到光路即可。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置2、相板、相板位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫个区域，直射光通过的部分叫“共轭面共轭面”，衍射光通过的部分叫，衍射光通过的部分叫“补偿面补偿面”。带有。带有相板的物镜叫相差物镜，常以相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样字样标在物镜外壳上。标在物镜外壳上。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉吸收掉60%93%，相位膜为氟化镁等在，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟推迟1/4波长。波长。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置3、合轴调节望远镜、合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置4、绿色滤光片、绿色滤光片由于使用的照明光线的波长不同，由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的镜检时要使用该厂规定的IF550绿色绿色滤光片作为配套器件。滤光片作为配套器件。相差显微镜的相差显微镜的使用范围使用范围相差显微镜能观察到透明样品的细相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。究的必备工具。相差显微镜的相差显微镜的操作步骤操作步骤（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。的相差物镜。（2）将标本片放到载物台上。）将标本片放到载物台上。（3）进行光轴中心的调整。）进行光轴中心的调整。（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。操作与普通光学显微镜方法相同。相差显微镜的相差显微镜的注意事项注意事项（1）视场光阑与聚光器的孔径光阑）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。轭面又吸收大部分光。（2）不同型号的光学部件不能互换）不同型号的光学部件不能互换使用。使用。（3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。标准，不能过薄或过厚。（4）切片不能太厚，一般以）切片不能太厚，一般以510m为宜，否则会引起其他光学现为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。象，影响成像质量。荧光光显微微镜荧光光显微微镜是免疫是免疫荧光光细胞化学的胞化学的基本工具。它是由光源、基本工具。它是由光源、滤板系板系统和光学系和光学系统等主要部件等主要部件组成。是利成。是利用一定波用一定波长的光激的光激发标本本发射射荧光，光，通通过物物镜和目和目镜系系统放大以放大以观察察标本的本的荧光光图像。像。荧光是什么？荧光是什么？荧光光显微微镜-光源光源多采用多采用200W的超高的超高压汞灯作光源汞灯作光源国国产超高超高压汞灯汞灯GCQ-200型性能型性能良好，可以代替良好，可以代替HBO-200等型的等型的进口灯泡口灯泡荧光光显微微镜-滤色系统滤色系统滤色系色系统是是荧光光显微微镜的重要部位，由激的重要部位，由激发滤板和板和压制制滤板板组成。成。滤板型号，各厂家名称常不板型号，各厂家名称常不统一。一。滤板一般都以基本色板一般都以基本色调命名，前面字命名，前面字母代表色母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。荧光光显微微镜-滤色系统滤色系统1激激发滤板板根据光源和根据光源和荧光色素的特点，可光色素的特点，可选用以下三用以下三类激激发滤板，提供一定波板，提供一定波长范范围的激的激发光。光。紫外光激紫外光激发滤板：此板：此滤板可使板可使400nm以下的紫外以下的紫外光透光透过，阻，阻挡400nm以上的可以上的可见光通光通过。常用型号。常用型号为UG-1或或UG-5，外加一外加一块BG-38，以除去以除去红色尾波。色尾波。紫外紫外蓝光激光激发滤板：此板：此滤板可使板可使300450nm范范围内的光通内的光通过。常用型号。常用型号为ZB-2或或ZB-3，外加外加BG-38。紫紫蓝光激光激发滤板：它可使板：它可使350490nm的光通的光通过。常用型号常用型号为QB24（BG12）。）。最大吸收峰在最大吸收峰在500nm以上者的以上者的荧光素（如光素（如罗达明达明色素）可用色素）可用蓝绿滤板（如板（如B-7）激激发。荧光光显微微镜-滤色系统滤色系统2压制制滤板板压制制滤板的作用是完全阻板的作用是完全阻挡激激发光通光通过，提供，提供相相应滤长范范围的的荧光。与激光。与激发滤板相板相对应，常，常用以下用以下3种种压制制滤板：板：紫外光紫外光压制制滤板：可通板：可通过可可见光、阻光、阻挡紫紫外光通外光通过。能与。能与UG-1或或UG-5组合。常用合。常用GG-3K430或或GG-6K460。紫紫蓝光光压制制滤板：能通板：能通过510nm以上以上滤长的的荧光（光（绿到到红），能与），能与BG-12组合。通常合。通常用用OG-4K510或或OG-1K530。紫外紫光紫外紫光压制制滤板：能通板：能通过460nm以上以上波波长的的荧光（光（蓝到到红），可与），可与BG-3组合，常合，常用用OG-11K470AK490，K510。荧光光显微微镜-目镜目镜在在荧光光显微微镜中多用低倍目中多用低倍目镜，如，如5和和6.3。荧光光显微微镜标本制作要求本制作要求载玻片厚度玻片厚度应在在0.81.2mm之之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激一方面不能使激发光在光在标本上聚集。本上聚集。载玻片必玻片必须光光洁，厚度均匀，无，厚度均匀，无明明显自自发荧光。有光。有时需用石英玻璃需用石英玻璃载玻片。玻片。盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm左右，光左右，光洁。为了加了加强激激发光，也可用干涉盖玻光，也可用干涉盖玻片，片，这是一种特制的表面是一种特制的表面镀有若干有若干层对不同波不同波长的光起不同干涉作用的光起不同干涉作用的物的物质（如氟化（如氟化镁）的盖玻片，它可以使）的盖玻片，它可以使荧光光顺利通利通过，而反射激，而反射激发光，光，这种反射的激种反射的激发光女可激光女可激发标本。本。组织切片或其他切片或其他标本不能太厚，如太厚激本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在光大部分消耗在标本下部，本下部，而物而物镜直接直接观察到的上部不充分激察到的上部不充分激发。另外，。另外，细胞重迭或胞重迭或杂质掩盖，掩盖，影响判断。影响判断。封裱封裱剂常用甘油，必常用甘油，必须无自无自发荧光，无色透明，光，无色透明，荧光的亮度在光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.09.5的的碳酸碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱冲液的等量混合液作封裱剂。般暗般暗视野野荧光光显微微镜和用油和用油镜观察察标本本时，必，必须使用使用镜油，最好使用油，最好使用特制的无特制的无荧光光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率光率较低，低，对图像像质量略有影响。量略有影响。使用使用荧光光显微微镜的的注意事注意事项（1）严格按照格按照荧光光显微微镜出厂出厂说明明书要求要求进行操作，不要随意改行操作，不要随意改变程序程序（2）应在暗室中在暗室中进行行检查。进入暗室后，接上入暗室后，接上电源，点燃超高源，点燃超高压汞汞灯灯515min，待光源待光源发出出强光光稳定后，眼睛完全适定后，眼睛完全适应暗室，再开始暗室，再开始观察察标本。本。（3）防止紫外）防止紫外线对眼睛的眼睛的损害，在害，在调整光源整光源时应戴上防戴上防护眼眼镜。（4）检查时间每次以每次以12h为宜，超宜，超过90min，超高超高压汞灯汞灯发光光强度逐度逐渐下降，下降，荧光减弱；光减弱；标本受紫外本受紫外线照射照射35min后，后，荧光也明光也明显减减弱；所以，最多不得超弱；所以，最多不得超过23h。（5）荧光光显微微镜光源寿命有限，光源寿命有限，标本本应集中集中检查，以，以节省省时间，保保护光源。天光源。天热时，应加加电扇散扇散热降温，新降温，新换灯泡灯泡应从开始就从开始就记录使用使用时间。灯熄。灯熄灭后欲再用后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避避免数次点燃光源。免数次点燃光源。（6）标本染色后立即本染色后立即观察，因察，因时间久了久了荧光会逐光会逐渐减弱。若将减弱。若将标本本放在聚乙放在聚乙烯塑料袋中塑料袋中4保存，可延保存，可延缓荧光减弱光减弱时间，防止封裱，防止封裱剂蒸蒸发。（7）荧光亮度的判断光亮度的判断标准：一般分准：一般分为四四级，即，即“一一”无或可无或可见微弱微弱荧光。光。“+”仅能能见明确可明确可见的的荧光。光。“+”可可见有明亮的有明亮的荧光。光。“+”可可见耀眼的耀眼的荧光。光。