基因工程-第三章-基因工程的载体课件.ppt
第三章 基因工程的载体n载体：携带外源基因进入受体细胞的工具n用于基因工程的载体用于基因工程的载体细菌质粒载体噬菌体衍生载体Cosmid载体Phagemid载体酵母质粒载体真核病毒载体Bacmid载体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新发展概况发展概况 1.1.第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利天然质粒和重组质粒的利用，如用，如pSC101,colE1,pSC101,colE1,pCRpCR,pBR313,pBR313和和pBR322(1977,pBR322(1977,Bolivar Bolivar et alet al)2.2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体的基本功能基本功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体必须具备的基本条件基本条件1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新遗传标记基因遗传标记基因 1.1.标记基因的作用标记基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主是否进入宿主细胞细胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（ApApr r ，TcTcr r ，KanKanr r），），也可以也可以是非选择性的（如是非选择性的（如lacZlacZ）2 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。*这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcTcS S），），也可以是也可以是非选非选择性择性的（如的（如TcTcS S，lacZlacZ,GUS,GUS），），绝大多数为后者。绝大多数为后者。*有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（选择性标记基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2.2.标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）a.a.抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Ap:Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b.b.重金属抗性基因重金属抗性基因:Cu:Cur r ，ZnZnr r ，CdCd r r c.c.代谢抗性基因代谢抗性基因:TK:TK，抗除草剂基因抗除草剂基因 2 2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。3 3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZlacZ,GUS,GUS,CATCAT 4 4）噬菌斑噬菌斑 2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新3.3.使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点 1 1）标记基因与宿主细胞）标记基因与宿主细胞 2 2）标记基因产物的作用机制）标记基因产物的作用机制:Ap:Apr r 3 3）标记基因的结构与适用范围标记基因的结构与适用范围:基因启动子基因启动子,翻译起翻译起始序列始序列,密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4）标记基因的结构变化对功能的影响）标记基因的结构变化对功能的影响:LacZLacZ,GUS,GUS 4.4.常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 1)1)四环素抗性基因四环素抗性基因（TcTcr r）Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中的一种亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种编码一种399 399 AAsAAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。素分子进入细菌细胞。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2)2)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r）AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解，使氨苄青霉素失活。，使氨苄青霉素失活。3)3)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r）ChlorophenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上，阻止蛋白质合亚基上，阻止蛋白质合成。成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。的氯霉素不能结合在核糖体上。4)4)卡那霉素卡那霉素(KanKanr r),),新霉素新霉素(NeoNeor r)和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r)基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞，使之不能进入细胞内。内。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新5 5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZlacZ 和和lacZlacZ）半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 1021 AAsAAs，基因产物不具酶活基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作互补作用用。这两个部分可独立存在，。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编链编码的基因称之为码的基因称之为lacZlacZ(编码编码145 145 AAsAAs)。这两个基因（这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。均可作为标记基因。半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点:a.a.酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b.b.lacZlacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c.c.lacZlacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新PLacZLacZ转录转录翻译翻译LacZLacZ基因的结构与产物基因的结构与产物pUC18BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZLacZ基因筛选重组子基因筛选重组子2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新6 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS）该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述酶。该标记基因除具有上述lacZlacZ基因的优点外，它的适用范围十分基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。广泛，因为许多生物中没有这种基因。7 7）荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入生荧光，若在反应中加入CoACoA，可使灵敏度提高可使灵敏度提高1010倍；或由发光细倍；或由发光细菌（菌（PhotobacteriumPhotobacterium fischerifischeri）产生的荧光素酶，它与产生的荧光素酶，它与FMN-FMN-氧化氧化还原酶联用，通过还原酶联用，通过NAD(P)HNAD(P)H的变化测定酶活的变化测定酶活。8 8）发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。大肠杆菌菌落呈蓝色。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新 分子克隆载体的复制起点与种类分子克隆载体的复制起点与种类1.1.复制起点的种类复制起点的种类 1)1)核内复制起点核内复制起点 a.a.染色体复制起点染色体复制起点原核生物原核生物(环状环状)和真核生物和真核生物(线状线状)染染色体色体 b.b.染色体外复制起点染色体外复制起点 i.i.质粒质粒DNA,RNA,DNA,RNA,线状线状,环状环状,单链单链,双链双链 ii.ii.病毒病毒同上同上,细胞内和病毒颗粒内细胞内和病毒颗粒内 2)2)核外复制起点核外复制起点 a.a.线粒体线粒体所有真核细胞所有真核细胞 b.b.叶绿体叶绿体所有绿色植物细胞所有绿色植物细胞 原核与真核生物原核与真核生物两种质体中亦可能含有质粒两种质体中亦可能含有质粒2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新3.3.按复制起点划分克隆载体按复制起点划分克隆载体 1)1)质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2)2)ARSARS复制型复制型ARSARS（autonomusautonomus replicativereplicative sequence)sequence)，或称染色体复制型或称染色体复制型3)3)病毒复制型病毒复制型复制起点来自病毒，若为复制起点来自病毒，若为RNARNA病毒，必病毒，必须反转录为须反转录为cDNAcDNA。4)4)混合复制型混合复制型 a.a.同种生物复制起点混合同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病质粒形式存在；质粒或病毒形式存在毒形式存在2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新例：大肠杆菌（例：大肠杆菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）载体既含有来自质粒载体既含有来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13M13）的复制起点。在不的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒获得质粒dsds-DNA-DNA或噬菌体或噬菌体ssss DNA DNA又如：酿酒酵母（又如：酿酒酵母（SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae）的某些载体既含有的某些载体既含有质粒（质粒（22）复制起点，又含有复制起点，又含有ARSARS片段片段 b.b.不同生物复制起点混合不同生物复制起点混合穿梭载体穿梭载体（shuttle vectorshuttle vector）两两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在种生物中以质粒或病毒形式存在 *穿梭载体范围穿梭载体范围：细菌：细菌细菌（放线菌），细菌细菌（放线菌），细菌酵母菌，酵母菌，细菌细菌真菌，细菌真菌，细菌动物动物2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新pBSpBS载体的结构载体的结构2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系数的关系 1.1.复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系1)1)质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies1-2 copies，受受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主受宿主染色体控制较弱）染色体控制较弱）2)ARS2)ARS型载体：拷贝数较高（约型载体：拷贝数较高（约20 copies20 copies）3)3)病毒型复制起点：高拷贝病毒型复制起点：高拷贝 2.2.标记基因与拷贝数的关系标记基因与拷贝数的关系 若若标标记记基基因因表表达达效效率率高高，宿宿主主细细胞胞可可能能不不大大量量产产生生标标记记基基因因以以满满足足选选择择压压力力要要求求，因因而而载载体体拷拷贝贝数数会会降降低低。对对于于不不同同标标记记基因，可采取相应方法提高其拷贝数。基因，可采取相应方法提高其拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。对对于于营营养养标标记记基基因因，可可降降低低该该基基因因的的表表达达效效率率或或更更换换其其他他低低效率的标记基因效率的标记基因2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新分子克隆载体的转化频率和稳定性分子克隆载体的转化频率和稳定性 1.1.影响转化频率的因素影响转化频率的因素 1)1)复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2)2)标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因 2.2.影响稳定性的因素影响稳定性的因素 1)1)复制起点类型复制起点类型低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差性差 2)2)选择压力选择压力 3)3)载体在宿主细胞中的状态载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性宿主细胞的遗传特性和生理特性2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA,ccc DNA）2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n自主复制性自主复制性n质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n不相容性不相容性n利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n可扩增性可扩增性npMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增氯霉素扩增。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n携带遗传标记携带遗传标记 n在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质3、分类接合型和非接合型严紧性和松弛型在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建1、理想质粒载体所具备的条件n质粒较小n质粒带有可供选择的标记n带有尽可能多的单一限制酶切位点n应有较高的基因表达能力2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建2、质粒人工构建的目的n 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新1.多拷贝质粒多拷贝质粒经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。2.测序质粒测序质粒拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆3.整合质粒整合质粒装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.穿梭质粒穿梭质粒含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制5.表达质粒表达质粒装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达6.探针质粒探针质粒筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。人工构建的质粒根据其功能及用途分为：2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322n大小：4.3kbn选择标记：AprTcrn单一酶切位点：EcoRHindBamHPstISal等2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322n用于组建pBR322的三个亲本质粒的特征：npSE2124：Apr基因npMB8:ColEI松弛型复制子npSC101:Tcr基因2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒n多拷贝大肠杆菌型质粒，包括pUC8/9pUC18/19npUC的亲本质粒是pBR322,包括如下四个部分：n来自pBR322的复制起点（ori）n来自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已发生改变）nE.coli的lacZ基因及其启动子组成lacZ基因nlacZ内部人工组装了一个多克隆位点（MCS）它含有如下单一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒npUC系列质粒的优点n更小的相对分子量和更高的拷贝数n可用组织化学法检测重组体n具有多克隆位点（MCS）区段是基因工程中目前最常用的是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体克隆载体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体三、质粒（plasmid）的制备1.碱裂解法（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质（5）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒（7）无DNase的RNase处理残余RNA2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新第一节E.coli质粒载体三、质粒（plasmid）的制备2.沸水浴法（1）将菌体悬浮在含有EDTA和TritonX-100的缓冲液中（2）加溶菌酶破细胞壁（3）放入沸水浴中煮40秒（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物（5）乙醇异丙醇沉淀2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新一、一、Ti质粒载体质粒载体1.根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与与Ti质粒质粒G-菌，可侵入菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：冠瘿瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体培养不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.ii.合成肿瘤特有的化合物合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱冠瘿碱(opine)(opine)，能专一能专一 的为根癌农杆菌所利的为根癌农杆菌所利用用.这两个特征由这两个特征由TiTi质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。三、其他质粒载体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新1)Ti质粒类型质粒类型（由（由Ti质粒所产生的冠瘿碱种类而定）质粒所产生的冠瘿碱种类而定）i.鱆鱼碱类鱆鱼碱类(octopine)ii.胭脂碱类胭脂碱类(nopaline)iii.农碱类农碱类(agropine)2)Ti质粒的结构质粒的结构i.环状环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区具六个功能区i)致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素ii)冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成iii)冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解iv)Ti质粒转移区质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移参与不同农杆菌中的接合转移v)毒（性）区：参与毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体的转移和插入植物染色体vi)DNA复制区：参与复制区：参与Ti质粒质粒DNA复制复制2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新Ti质粒的结构质粒的结构2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新ii.T-DNAT-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25bp重复重复序列，序列，T-DNA整合不具特异性，右侧整合不具特异性，右侧25bp重复序列对重复序列对T-DNA的的转移至关重要。转移至关重要。不同不同Ti质粒中的质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中结构是不相同的，其中i)胭脂碱胭脂碱Ti质粒的质粒的T-DNA长长23bp,结构连续，具结构连续，具13个基因个基因ii)鱆鱼碱鱆鱼碱Ti质粒中的质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为不连续，分左右两段，分别称之为TL和和TR,TLDNA长长13.2kb,含含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因合成基因,TRDNA长长7.9kb，含含5个基因，参与甘露碱个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成和农碱合成 iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。两者同源性：主要集中在植物激素合成区。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新Ti质粒的质粒的T-DNA的同源性的同源性2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2.Ti质粒载体质粒载体1)Ti质粒作为载体的问题质粒作为载体的问题i)太大，无适合克隆位点太大，无适合克隆位点ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株的存在不能使转化细胞再生为完整植株2)载体类型载体类型i)中间载体中间载体(intermediatevector)由以下几部分组成：由以下几部分组成：适合于适合于E.coliE.coli和和A.tumefaciensA.tumefaciens自主复制和选择用标记基因自主复制和选择用标记基因 适合于植物细胞选择用标记基因适合于植物细胞选择用标记基因 一段来自天然一段来自天然TiTi质粒的部分质粒的部分T-DNAT-DNA序列（提供同源重组）序列（提供同源重组）1-21-2个来自个来自T-DNAT-DNA的的25bp25bp重复序列重复序列 用于表达外源基因的用于表达外源基因的DNADNA序列（如启动子、终止子序列序列（如启动子、终止子序列）2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新重组重组重组重组DNADNA的转移过程的转移过程的转移过程的转移过程：中间载体或重组子中间载体或重组子E.coli(中宿主中宿主)A.tumefaciens在在根癌农杆菌中与天然根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生质粒或非致瘤质粒发生共整合作用共整合作用感染植物受伤组织或与植物细胞共培养感染植物受伤组织或与植物细胞共培养T-DNA进入植物细胞并整合到染色体进入植物细胞并整合到染色体DNA中中外源基因表达外源基因表达转化转化接合接合转移转移2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新根癌农杆菌中根癌农杆菌中Ti质粒的转移质粒的转移2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新Ti质质粒粒衍衍生生的的植植物物克克隆隆载载体体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新二、二、酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆载体的分子克隆载体1.克隆载体的种类克隆载体的种类1)按复制方式划分按复制方式划分i.自主复制型；自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分按复制子来源划分i.附加体型附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起点来自于酿其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒酒酵母的天然质粒-2质粒质粒ii.染色体复制型染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其复制起点来其复制起点来自染色体上的自主复制序列自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他质粒载体2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新酿酿酒酒酵酵母母载载体体的的种种类类和和构构建建2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新*若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体YCp-YeastCentrometricplasmid*若在若在YCp或或YRp中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为YLp-YeastLinearplasmid*若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(YeastArtificialChromosome)3)标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变）是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在，利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在E.coliE.coli的转化体的转化体中来鉴别的。中来鉴别的。2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新2.酵母克隆载体的结构与特点酵母克隆载体的结构与特点1)穿梭载体，穿梭载体，YIp除外除外2)有适合两种生物的标记基因有适合两种生物的标记基因3)环状或线状环状或线状DNA 详见下表详见下表2/1/2023苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶叶叶叶亚新亚新亚新亚新载体类型载体类型存在方式存在方式所需所需DNA序列序列标记基因标记基因转化频率转化频率稳定性稳定性（菌落（菌落/gDNA）无丝分裂无丝分裂有丝分裂有丝分裂整合型整合型整合整合与染色体与染色体DNAAprTcr10+a+a(YIp5)1-几个拷贝几个拷贝同源同源URA3附加体型附加体型自主复制自主复制2质粒质粒AprTcr103-104-b-c(YEp13)多拷贝多拷贝LEU2复制型复制型自主复制自主复制ARSAprTcr103-104-b-c(YRp7)多拷贝多拷贝TRP1着丝粒型着丝粒型染色体状染色体状ARS,CENApr103-104+d+d(YCp19)通常单拷贝通常单拷贝TRP1,URA3线型线型染色体状染色体状ARS，CENTRP1，HIS3103-104+e+(YLp21)通常单拷贝通常单拷贝TELa.每次细胞分裂仍有约每次细胞分裂仍有约1%的载体的载体DNA从染色体上脱落下来从染色体上脱落下来b.在选择培养基中在选择培养基中15-20代后，代后，10-30%的转化子丢失载体的转化子丢失载体DNAc.非孟德尔式分离，主要是非孟德尔式分离，主要是4+：0-d.无丝分裂时有无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于
