第二代和第三代慢病毒包装系统.pdf
第二代和第三代慢病毒包装系统将 HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离.载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV1 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。第一代包装系统中,除 vpu 之外的辅助基因都被保留下来，Env 包膜蛋白由VSVG 蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性。3 质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒.其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白(VSV 2G）,应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度;转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因（绿色荧光蛋白 GFP）。在第二代系统中辅助基因 vif、vpr、nef 被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性.第二代系统中5LTR 634bp,3 LTR 634bp，5LTR前不需要强启动子。4 质粒系统.第三代系统中，tat 调节基因也被剔除，对5LTR进行了改造,换上了异源启动子，从而不需依赖 tat 基因（Tat 基因编码蛋白可与 LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了 U3 区的 3LTR，使载体失去 HIV-1 增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入,如 cPPT、WPRE。因此，第三代系统的安全性大大提升,进一步减少重组成复制型病毒（RCV）的可能性。5 LTR（truncated)181bp，3 LTR(U3）234bp,5LTR前要有强启动子。4 质粒系统。VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度。a、包装质粒InvitrogenpLP1 VectorpLP2 VectorPlp/VSVGClontechHelper1Helper2Helper3Helper4Helper5Didier TronopMDLg/pRREpRSVRevpMD2.G2th generationpCMV 8。91pMD VSV-GpCMV-VSV-GpsPAX2表达元件gag/polRevVSVG表达元件gagprovpr-polVSVGTetofftatIRES-rev表达元件gag/polRevVSVG表达元件gag/pol/tat/revVSV-GVSV-Ggag/pol备注三质粒第三代系统。兼容性好，能与多数表达载体一起转染包装。备注五质粒第四代系统.号称无需浓缩达到5*108IFU/ml。兼容型好.引入 Tet-off 诱导表达.备注来自 Didier Trono 实验室,科研院校常用系统。第三代系统，经典骨架.1998备注科研院校常用二代系统,也是 Trono lab构建的。Weinberg RA，2003 第二代系统Didier TronoInvitrogen 的 3 个质粒与 Didier Trono 的第三代系统的 3 个质粒相同。第三代慢病毒载体系统由 4 个质粒构成，分别是：（1）1 个具有目的基因的慢病毒表达质粒。表达质粒包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。目的基因两侧各有一个LTR（long terminalrepeat）序列，LTR 序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能，表达质粒的 3LTR 缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。(2)2 个包装质粒。其中一个质粒编码 Rev，另外一个质粒编码 Gag 和 Pol。（3）1 个编码包膜蛋白的质粒.将上述 4 个质粒共转染细胞。GAG基因编码约 500 个氨基酸组成的 p55 蛋白前体，经蛋白酶裂解形成病毒的核衣壳蛋白（p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白（p24)。POL基因编码聚合酶前体蛋白,经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶 H。REV基因编码 Rev 蛋白。表达质粒经转录产生慢病毒基因组 mRNA，Rev 蛋白与慢病毒基因组 mRNA 中的 RRE 结合，将基因组 mRNA 从细胞核转运到细胞质中。基因组 mRNA 与衣壳蛋白、逆转录酶、整合酶、包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。3 LTR（U3）(234bp)包括 5 LTR（truncated）（181bp)序列，5 LTR（truncated）在 3 LTR(U3）的末端。
