《核酸组织化学》PPT课件.ppt

核酸组织化学 组胚教研室 姜玉峰核酸：核酸：1.1.核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）：核仁和核糖体）：核仁和核糖体 2.2.脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNADNA）：核内的染）：核内的染色质或染色体色质或染色体 Feulgen Feulgen反应反应19241924年提出年提出,特异性显示特异性显示DNADNA分子形分子形态学方法态学方法DNADNA在酸性环境下水解在酸性环境下水解,断开糖苷键断开糖苷键,形成醛基形成醛基醛基再与醛基再与shiffshiff液中的碱性品红特异液中的碱性品红特异性结合性结合,形成紫红色醌基形成紫红色醌基 Feulgen Feulgen反应反应应用应用：肿瘤细胞具有高增生的肿瘤细胞具有高增生的DNADNA含量含量,鉴鉴别并协助诊断肿瘤的良恶性别并协助诊断肿瘤的良恶性细胞及原代培养细胞细胞及原代培养细胞DNADNA分子的检测分子的检测与鉴定与鉴定 Feulgen Feulgen反应反应Schiff液的配制液的配制0.05g0.05g碱性品红研细，溶于含碱性品红研细，溶于含0.5mL0.5mL浓浓HClHCl的的50mL50mL水中，再加入水中，再加入0.5g 0.5g NaNa2 2SOSO3 3固体，搅拌后，静置，直到红固体，搅拌后，静置，直到红色褪去色褪去 Feulgen反应步骤反应步骤 1.1.石蜡切片石蜡切片 2.2.切片脱蜡入水切片脱蜡入水 3.3.切片用切片用1mol/L HCL1mol/L HCL冲洗冲洗 4.1mol/L HCL60 4.1mol/L HCL60 温箱水解温箱水解8 min8 min 5.5.室温室温1mol/L HCL1mol/L HCL冲洗冲洗 Feulgen反应步骤反应步骤6.6.蒸馏水洗蒸馏水洗 7.7.暗处入暗处入SchiffSchiff液染色液染色60 min60 min8.8.亚硫酸钠溶液洗亚硫酸钠溶液洗3 3次约次约6 min6 min9.9.蒸馏水洗蒸馏水洗 10.10.脱水透明、封固。脱水透明、封固。Feulgen反应注意事项反应注意事项1.1.不能用含甲醛固定液，可用不能用含甲醛固定液，可用CarnoyCarnoy固定液固定液2.2.尽量不用冰冻切片，减少非特异染尽量不用冰冻切片，减少非特异染色色3.3.控制盐酸水解温度和时间控制盐酸水解温度和时间 吖啶橙染色吖啶橙染色三环芳香类阳离子型碱性荧光染料三环芳香类阳离子型碱性荧光染料嵌入核酸双链的碱基对嵌入核酸双链的碱基对与单链核酸的磷酸发生静电相互作与单链核酸的磷酸发生静电相互作用用 吖啶橙染色吖啶橙染色与与DNADNA结合结合,525nm,525nm,绿色荧光绿色荧光与与RNARNA结合结合,650nm,650nm,橙红色荧光与单橙红色荧光与单链核酸的磷酸发生静电相互作用链核酸的磷酸发生静电相互作用 吖啶橙染色吖啶橙染色应用应用：区分活细胞和死细胞区分活细胞和死细胞,活细胞核呈黄活细胞核呈黄绿色荧光绿色荧光,死细胞呈红色荧光死细胞呈红色荧光(溶酶溶酶体酶释放所致体酶释放所致)原位区分组织细胞原位区分组织细胞DNADNA和和RNARNA 吖啶橙染色吖啶橙染色应用应用：恶性肿瘤普查恶性肿瘤普查:非典型增生非典型增生:荧光增强荧光增强增生细胞增生细胞:强荧光强荧光恶性肿瘤细胞恶性肿瘤细胞:橘红色或火焰橘红色或火焰吖啶橙染色步骤吖啶橙染色步骤1.95%1.95%酒精固定酒精固定 2.2.滴加滴加0.01%0.01%浓度的吖啶橙荧光染液染浓度的吖啶橙荧光染液染色色5min5min3.PBS3.PBS漂洗漂洗lminlmin4.4.用用0.1mol0.1molL L氯化钙溶液分色氯化钙溶液分色lmin lmin 5.PBS5.PBS冲洗、封片冲洗、封片,荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察 吖啶橙染色注意事项吖啶橙染色注意事项1.1.吖啶橙浓度过高吖啶橙浓度过高(1:500)(1:500)或过低或过低(1:10(1:105 5),),影响准确性和可信性影响准确性和可信性2.2.甲醛固定的石蜡切片效果不理想甲醛固定的石蜡切片效果不理想3.PH6.0,DNA3.PH6.0,DNA结合染料的聚合加速结合染料的聚合加速,PHPH低于低于3.8,DNA3.8,DNA结合染料的聚合抑制结合染料的聚合抑制 DAPI DAPI染色染色4 4，6 6二脒基二脒基-2-2苯吲哚苯吲哚与与DNADNA特异性结合的荧光染料特异性结合的荧光染料可以穿透活细胞胞膜，无明显细胞可以穿透活细胞胞膜，无明显细胞毒性毒性与双链与双链DNADNA结合结合,荧光强度增强荧光强度增强2020倍倍,与单链与单链DNADNA结合结合,无荧光增强无荧光增强DAPI染色步骤染色步骤1.1.培养细胞或组织冰冻切片培养细胞或组织冰冻切片,PBS,PBS漂洗漂洗5min5min2.DAPI2.DAPI工作液室温染色工作液室温染色5-20 min5-20 min3.PBS3.PBS漂洗漂洗4.4.水溶性封片剂封片水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观荧光显微镜下观察察 *较多单转较多单转150Q细胞胞核凋亡，细胞胞核凋亡，多数共转多数共转150Q和和GRP78细胞胞细胞胞核正常核正常150Q GRP78 DAPI改变改变GRP78水平对突变水平对突变Htt细胞毒性的影响细胞毒性的影响DAPIDAPI染色染色DAPI染色优点染色优点1.1.荧光稳定性优于荧光稳定性优于HoechstHoechst2.2.特异性较特异性较EB,PIEB,PI高高 Hoechst33258 Hoechst33258染色染色u非嵌入性的荧光染料非嵌入性的荧光染料u与与DNADNA小沟富集小沟富集ATAT的区域结合的区域结合u活细胞或固定细胞活细胞或固定细胞u亮蓝色荧光亮蓝色荧光Hoechst33258染色步骤染色步骤1.1.培养细胞或细胞悬液培养细胞或细胞悬液,PBS,PBS漂洗漂洗5min5min2.Hoechst332582.Hoechst33258工作液室温染色工作液室温染色15min15min3.PBS3.PBS漂洗漂洗4.4.水溶性封片剂封片水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观荧光显微镜下观察察 碘化丙啶（碘化丙啶（PIPI）染色）染色不能透过完整的细胞膜不能透过完整的细胞膜正常细胞和凋亡细胞正常细胞和凋亡细胞PIPI拒染拒染坏死细胞核染红色坏死细胞核染红色 PIPI染色染色应用：区分应用：区分凋亡和坏死细胞凋亡和坏死细胞AnnexinV-FITCAnnexinV-FITCPIPI双染流式细胞术：双染流式细胞术：细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)(PS)迁迁移至细胞外侧，移至细胞外侧，AnnexinVAnnexinV和和PSPS具极具极强的强的结合力，坏死细胞和凋亡细胞结合力，坏死细胞和凋亡细胞绿色绿色坏死细胞核被坏死细胞核被PIPI染成红色染成红色 双变量双变量FCMFCM的散点图的散点图左下象限显示正常活细胞，为左下象限显示正常活细胞，为FITC-FITC-，PIPI-；右上象限为坏死细胞，为右上象限为坏死细胞，为FITCFITC+，PI+PI+；右下象限为凋亡细胞，呈现右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+FITC+PIPI-