生理指标的测定(共6页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上一 叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法参照张宪政（1986）的方法:1、先配制乙醇：丙酮=1：1的混合溶液（80%:80%）装入棕色瓶中保存。2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50 ml的培养瓶中，再加入20 ml的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于10冷库避光存放36 h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。3、避光保存36 h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照，在紫外分光光度计下分别测定652 nm、663 nm和645 nm处的吸光值。4、计算公式叶绿素a的含量=（12.7*OD663-2.69*OD645）/50+（22.9*OD663-4.68*OD645）/50 叶绿素b的含量=（22.9*OD663-4.68*OD645）/50 总叶绿素的含量=（20.2* OD645+8.02* OD663）*V/1000*W或 总叶绿素的含量=(A652 /34.5)*V/1000*W (叶绿素a和叶绿素b在652nm下有相同的吸光系数，为34.5)其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为mg/g(FW).二、维生素C含量的测定李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2，6二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的干扰。1、原理：向一定量提取液中加入过量的2，6二氯酚靛酚染料溶液与维生素C作用后，多余染料用二甲苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测定结果。2、试剂 （按照定容100ml计算）(1) 1%草酸，称取1.4g；(2) 2%草酸, 称取2.8g；(3) 30%硫酸锌, 称取53.4g；(4) 15%亚铁氰化钾, 称取17.2g；(5) 染料溶液：称取100mg2，6二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60ml热水中，过滤定容至100ml容量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C。(6) 抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸，定容至100ml，再从中吸取5ml，用1%草酸再稀释至100ml, 稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配置）(7) 二甲苯,分析纯（本法使用过的二甲苯可用20%NaOH中和后，蒸馏回收）。3、实验步骤(1) 标准曲线去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至4ml，各管中抗坏血酸含量相应为0mg、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加入染料溶液2ml，随即加入二甲苯5ml, 迅速摇动约0.5min, 静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻倒入比色杯，在500nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的吸光度值的回归方程。(2) 样品提取取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放置研钵中，加入3ml2%草酸研钵至匀浆，然后将匀浆倒置100ml容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，洗液一并倒置容量瓶中，加入1ml30%硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氯化钾，以除去脂溶性色素，再用1%草酸定容至刻度，摇匀后过滤到干净小烧杯中。（3）测定取上述提取液4ml(若抗坏血酸含量高，可适当减少取量，不足4ml的可用1%草酸补足至4ml)至具塞大试管中，依次加入染料2ml、二甲苯5ml，按照标准曲线的方法测定吸光度。（4）计算根据测定液的吸光度值，按回归方程计算出抗坏血酸的毫克数，然后按下式计算样品中的抗坏血酸的含量，以每百克鲜样含抗坏血酸毫克数（mg/g）表示。每克鲜样的抗坏血酸含量=X*Vt/(W*Vm)（mg/g）式中；X为4ml提取液中含抗坏血酸的毫克数；Vt为提取液总体积ml；W为样品鲜重g；Vm为测定用体积量ml。三、蛋白质的测定考马斯亮蓝法 1、 称取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 100 gml的原液。称取100 mg考马斯亮蓝G250，溶于50 ml 90乙醇中，加入 85（mv）的磷酸 100 ml，最后用蒸馏水定容到 1000 ml。标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。操作项目管 号1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液(ml)0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水(ml)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂(ml)各5蛋白质含量（g）0 20 40 60 80 100盖上塞子，摇匀。放置2 min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2、 称取样品0.51.0 g，放入研钵中，加入5 ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000 rmin，10 min），将上清液倒入10 ml容量瓶，再向残渣中加入2 ml蒸馏水，悬浮后再离心10 min，合并上清液，定客至刻度。另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5 ml考马斯亮蓝G250试剂，充分混合，放置2 min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算：样品蛋白质含量（gg鲜重）（查得的蛋白质含量（g）×提取液总体积（ml）（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml）四、 可溶性糖的测定蒽酮比色法1、 原理:糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 2、试剂 (1) 葡萄糖标准溶液（ 100 g/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 g/mL ）。 (2) 蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 3 周。买98酸进行稀释。经查80%硫酸密度为：1.73，98%硫酸密度为1.84。两种方法配制：1、取较少量水加入98%硫酸，并不断搅拌，待温度降到室温，测定稀释后的密度，如果密度等于1.73，就说明硫酸的浓度为80%了，密度偏高就将混合后的酸加入少量水中，密度偏低就再加些98%硫酸，重复该动作直到密度等于1.73。2、以配制1000ml为例，80%的硫酸重量为：1000*1.73=1730g，纯硫酸重量为：1730*80%=1384g，折算成98%酸为：1384/0.98=1412g，也就是说配制1000ml 80%的硫酸，98%硫酸的用量为1412g，水为1730-1412=318g。因此称取水318g加入98%硫酸1412g，并不断搅拌待溶液冷却到室温时再加入少量水直至总重量为1730g（因为硫酸稀释后会放热，部分水会被蒸发）。 3、实验步骤 (1) 标准曲线制作 取6 支大试管，从 05 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 100 g/mL 葡萄糖溶液（ mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ mL ） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒽酮试剂（ mL ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 葡萄糖量（ g ） 0 20 40 60 80 100 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ g ）为横坐标绘制标准曲线。 (2)样品中可溶性糖的提取 称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 1.0 g （或干样粉末 5 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 30 min ，取出冷却，过滤入 25 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。(3)取提取液（茎0.1ml、叶0.5ml）于试管中，用水补充至1ml,加入5ml蒽酮，置沸水中煮沸10min，冷却至室温测定(4) 计算 可溶性糖含量%=AC/W .100% A为提取液稀释后的体积（1ml）；C为提取液的含糖量（g/mL）W为植物鲜重量（g）七、过氧化物酶活性的测定（POD）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 原理 : 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 (在一定的时间内，反应时间跟OD值成正相关性)二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 马铃薯块茎。 (二)试剂 1 . 100 mmol / L 磷酸缓冲液 pH6.0 (见附录)。 2 .反应混合液： 100 mmol / L 磷酸缓冲液( pH6.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 l ，混合均匀，保存于冰箱中。 (三)仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。 三、实验步骤 1 .称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r / min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 .取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之)，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /min · g (鲜重) 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。 过氧化物酶活性 u/ ( g · min ) = 式中： A 470 反应时间内吸光度的变化。 W 植物鲜重， g 。 V T 提取酶液总体积， mL 。 V s 测定时取用酶液体积 , mL 。 t 反应时间， min 。 · 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定【实验原理】SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02-+02-+ 2H+   H202+02由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。目前常用的方法有3种, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。SOD抑制氯化硝基四氮唑蓝（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在的条件下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易在氧化而产生氧气，可将NBT还原为蓝色的贾（月+赞）后者在蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。由于SOD可清除氧气，因此抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低。试剂:1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA2.220m mol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。【实验步骤】1酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀，4下 10000r/min离心15min 上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2.酶活性测定取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计: 试剂用量(ml )终浓度(比色时)50m mol/l   (PBS)220m mol/l   Met1.25m mol/l NBT0.033m mol/l核黄素酶液总体积        4.05         0.30.3         0.3     0.055.0 13m mol/l75µ mol/l2.0µ mol/l对照以缓冲液代替酶液将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计算SOD活性：SOD总活性= SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度      式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以 U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.过氧化物酶(POD)活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。(CAT)催化如下反应：            2 H2022 H20+ 02本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品 1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml【实验步骤】 酶液的制备 1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min 离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。 2. CAT活性的测定在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。 3. POD活性的测定  在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。4. 用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。五、 木质素的测定参照蒋挺大的方法。准确称取绿芦笋均匀样品20.00g，加入5ml 72% 硫酸匀浆，转入烧杯中，再加入15ml 72%硫酸。搅拌均匀放置4h，转入250ml三角瓶中，加水至250ml，煮沸2h。将滤纸在60条件下烘干1h 称重为m0，抽滤，残渣用水冲洗56 次，滤渣连同滤纸一并放于烘箱中60烘干2h，取出后称重为m1。每100g 新鲜绿芦笋中木质素的含量M 为：M(g/100g fw)=(m1 m0)×5式中：m0 为烘干滤纸的质量，g；m1 为滤渣和滤纸烘干后的总质量，g 。六、粗纤维含量的测定参考GB/T5009.10-2003酸碱洗涤法。称取10g鲜嫩茎样品（切成5mm厚的嫩茎段），移入100ml锥形瓶中，加入100ml煮沸的1.25%硫酸，加热使微沸，保持体积恒定，维持30分钟，每隔5分钟摇动锥形瓶一次。纱布过滤后，用沸水洗涤至洗液不呈酸性。再用100的1.25%氢氧化钾溶液，加热微沸30分钟后，用沸水洗涤至洗液不呈碱性，移入已干燥称重的M1垂熔坩埚或同型号的垂熔漏斗中抽滤，用热水充分洗涤后，抽干。在依次用乙醇和乙醚洗涤一次。将坩埚和内容物在105烘箱中烘干后称重，重复操作，直至恒重。每处理测试重复3次，取平均值。专心-专注-专业