《显微摄影技术》PPT课件.ppt

显微摄影技术显微摄影技术廖继东电话：电话：什么是显微摄影？什么是显微摄影？n n 显微摄影：显微摄影：利用摄影装置（传统相机、数码相利用摄影装置（传统相机、数码相机、专用机、专用CCD等）拍摄显微镜视野中所等）拍摄显微镜视野中所观察到的物像。观察到的物像。n n影像质量取决于：影像质量取决于：样本制作质量样本制作质量样本制作质量样本制作质量；显微镜光学性能；显微镜光学性能；显微镜光学性能；显微镜光学性能；摄影装置性能；摄影装置性能；摄影装置性能；摄影装置性能；操作者技术水平。操作者技术水平。操作者技术水平。操作者技术水平。内内 容容n n光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n光学显微镜主要光学部件及性能光学显微镜主要光学部件及性能n n与显微摄影有关的基本光学概念与显微摄影有关的基本光学概念 n n显微摄影系统的基本构成显微摄影系统的基本构成n n显微摄影基本操作程序显微摄影基本操作程序n n影响显微成像质量的因素影响显微成像质量的因素光学显微镜种类及结构特征光学显微镜种类及结构特征n n按照其按照其按照其按照其光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式：正置显微镜正置显微镜正置显微镜正置显微镜 倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜 体视镜体视镜体视镜体视镜 偏光镜等；偏光镜等；偏光镜等；偏光镜等；n n按照其照明按照其照明按照其照明按照其照明光源性质光源性质光源性质光源性质：可见光（明视场、弱视场）可见光（明视场、弱视场）可见光（明视场、弱视场）可见光（明视场、弱视场）荧光（紫外、红外）显微镜荧光（紫外、红外）显微镜荧光（紫外、红外）显微镜荧光（紫外、红外）显微镜 激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光谱显微镜；光谱显微镜；光谱显微镜；光谱显微镜；n n按机械部件的按机械部件的按机械部件的按机械部件的控制方式控制方式控制方式控制方式：手动手动手动手动 电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n明视场明视场明视场明视场（可见光）（可见光）（可见光）（可见光）照明光源采用照明光源采用照明光源采用照明光源采用普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素灯灯灯灯，主要用于常规染色组织标本的观察：，主要用于常规染色组织标本的观察：，主要用于常规染色组织标本的观察：，主要用于常规染色组织标本的观察：组织化学染色样本组织化学染色样本组织化学染色样本组织化学染色样本 免疫组织化学染色样本；免疫组织化学染色样本；免疫组织化学染色样本；免疫组织化学染色样本；n n弱视场弱视场弱视场弱视场包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能力，主要用于活组织未染色样本的观察。力，主要用于活组织未染色样本的观察。力，主要用于活组织未染色样本的观察。力，主要用于活组织未染色样本的观察。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n荧光荧光显微镜：显微镜：照明光源采用照明光源采用照明光源采用照明光源采用汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯，通过不同的，通过不同的，通过不同的，通过不同的滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发/发射光，发射光，发射光，发射光，用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。由于冷光源技术（由于冷光源技术（由于冷光源技术（由于冷光源技术（金属卤素灯）金属卤素灯）金属卤素灯）金属卤素灯）的开发及荧的开发及荧的开发及荧的开发及荧光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获得了广泛的应用。得了广泛的应用。得了广泛的应用。得了广泛的应用。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n激光共聚焦显微镜：激光共聚焦显微镜：利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像。n n光谱显微镜：光谱显微镜：采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发/发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察内内 容容n n光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n光学显微镜主要光学部件及性能光学显微镜主要光学部件及性能n n与显微摄影有关的基本光学概念与显微摄影有关的基本光学概念 n n显微摄影系统的基本构成显微摄影系统的基本构成n n显微摄影基本操作程序显微摄影基本操作程序n n影响显微成像质量的因素影响显微成像质量的因素光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜成像原理显微镜成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数透镜及其性能透镜及其性能n n透镜透镜（lens):透镜是由透明物质（如玻璃等）透镜是由透明物质（如玻璃等）制成的一种光学元件。制成的一种光学元件。n n透镜是折射镜，其折射面是两个球面，或一透镜是折射镜，其折射面是两个球面，或一个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚像。像。n n透镜一般可以分为两大类：透镜一般可以分为两大类：凸透镜凸透镜和和凹透镜凹透镜。中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜，有双凸、中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜，有双凸、平凸、凹凸三种；中央部分比边缘部分薄的平凸、凹凸三种；中央部分比边缘部分薄的叫凹透镜，有双凹、平凹、凸凹三种。叫凹透镜，有双凹、平凹、凸凹三种。n n凸透镜凸透镜具有会聚光线的作用，所以也叫会聚具有会聚光线的作用，所以也叫会聚透镜。透镜。n n凹透镜凹透镜具有发散光线的作用，所以也叫发散具有发散光线的作用，所以也叫发散透镜。透镜。n n透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个或多个透镜组成。或多个透镜组成。n n虚像虚像/实像实像：光线通过凹透镜后，成正立虚：光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。上显现出来，而虚像不能。n n焦点与焦平面焦点与焦平面：当一束平行于光轴当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称个点称“焦点焦点”；通过交点并垂直光；通过交点并垂直光轴的平面，称轴的平面，称“焦平面焦平面”。焦点有两。焦点有两个，在物方空间的焦点，称个，在物方空间的焦点，称“物方焦物方焦点点”，该处的焦平面，称，该处的焦平面，称“物方焦平物方焦平面面”；反之，在像方空间的焦点，称；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点像方焦点”，该处的焦平面，称，该处的焦平面，称“像方焦平面像方焦平面”。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数显微镜的成像原理显微镜的成像原理n na.a.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；n nb.b.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像；焦距上形成同样大小的倒立实像；焦距上形成同样大小的倒立实像；焦距上形成同样大小的倒立实像；n nc.c.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像倒立实像倒立实像倒立实像；n nd.d.当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；n ne.e.当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的的的的直立虚像直立虚像直立虚像直立虚像。显微镜的成像原理就是利用上述（显微镜的成像原理就是利用上述（c）和）和（e）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F（F为物方焦距）之间，则在物镜像方的为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距F1之内，之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）、人眼的明视距离（同侧）、人眼的明视距离（250mm）处形成）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像于原物体的像，方向相反。看到的像于原物体的像，方向相反。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n 色差色差色差色差（ChromaticChromatic aberrationaberration）：）：）：）：色差是透色差是透色差是透色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红源的情况下，单色光不产生色差。白光由红源的情况下，单色光不产生色差。白光由红源的情况下，单色光不产生色差。白光由红 橙橙橙橙 黄黄黄黄 绿绿绿绿 青青青青 蓝蓝蓝蓝 紫紫紫紫 七种组成，各种光的波长不同七种组成，各种光的波长不同七种组成，各种光的波长不同七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个方一个点，在像方则可能形成一个方一个点，在像方则可能形成一个方一个点，在像方则可能形成一个色斑色斑色斑色斑。色差色差色差色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。n n球差球差(Sphericalaberration)：球差是轴上球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的边缘逐渐模糊的亮斑亮斑。从而影响成像质量。从而影响成像质量。球差的矫正常利用透镜球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。n n慧差慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色相差。慧差属轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到得到一逗点壮一逗点壮，型如慧星，故称，型如慧星，故称“慧差慧差”。n n像散像散（Astigmatism）：）：像散也是影响清晰像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个合后，形成一个椭圆形的斑点椭圆形的斑点。像散是通过复。像散是通过复杂的透镜组合来消除。杂的透镜组合来消除。n n场曲场曲（Curvatureoffield）：）：场曲又称场曲又称“像像场弯曲场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时这样在镜检时不能同时看清整个相面不能同时看清整个相面，给观察，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是般都是平场物镜平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。，这种物镜已经矫正了场曲。n n畸变畸变（Distortion）：）：前面所说各种相差除前面所说各种相差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真。状上造成失真。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n物镜物镜（objective）:物镜是显微镜最物镜是显微镜最主要的光学部件，显微镜的分辩力主主要的光学部件，显微镜的分辩力主要取决于物镜的数值孔径（镜口率，要取决于物镜的数值孔径（镜口率，numerical aperture,NA）。）。n n目前常见物镜：消色差物镜、复消色目前常见物镜：消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜。差物镜。数值孔径数值孔径(NA)n n数值孔径数值孔径（numerical aperture,NA），是，是物镜和聚光镜的重要技术参数，是判物镜和聚光镜的重要技术参数，是判断光学元件性能的重要标志。断光学元件性能的重要标志。n n它是物镜前透镜与被检物体之间介质它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率的折射率(Eta)(Eta)和孔径角和孔径角(u(upsilon)(upsilon)半数的半数的正弦之乘积。用公式表示如下：正弦之乘积。用公式表示如下：NA=sinu/2。n n消色差物镜消色差物镜（achromatic objective,Ach）。这是一种常见的）。这是一种常见的物镜，物镜外壳上不列代表标志。物物镜，物镜外壳上不列代表标志。物镜把光谱中红蓝光聚焦于一点，黄绿镜把光谱中红蓝光聚焦于一点，黄绿光聚焦于一点，最清晰范围为光聚焦于一点，最清晰范围为510630纳米。这种物镜一般不适宜作摄纳米。这种物镜一般不适宜作摄影用，如加黄绿滤光镜，可获得较为影用，如加黄绿滤光镜，可获得较为清晰的照片。清晰的照片。n n复消色差物镜复消色差物镜（apochromatic objective,Apo）。这种物镜能把光镜）。这种物镜能把光镜中红、蓝、黄光聚焦于一点，纠正了红中红、蓝、黄光聚焦于一点，纠正了红蓝光的色差和黄绿光的球差，最佳清晰蓝光的色差和黄绿光的球差，最佳清晰范围为范围为400720纳米。这种物镜适用于纳米。这种物镜适用于在任何色光下或加用各色滤色镜进行观在任何色光下或加用各色滤色镜进行观察摄影，适用于彩色摄影。但察摄影，适用于彩色摄影。但Apo物镜物镜残留有像场弯曲，使平面物体形成类似残留有像场弯曲，使平面物体形成类似球面的弯曲影像，结果使视野中心和边球面的弯曲影像，结果使视野中心和边缘的影像不能同时聚焦，拍出的底片中缘的影像不能同时聚焦，拍出的底片中心清晰，边缘模糊或者相反。心清晰，边缘模糊或者相反。n n半复消色差物镜半复消色差物镜（荧光石镜，（荧光石镜，fluorite objective,Fl）。最佳清晰范围）。最佳清晰范围430680纳米，色差校正介于消色差物镜与复纳米，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间。消色差物镜之间。n n平场消色差物镜平场消色差物镜(plan achromatic objective,lp)。这种物镜纠正了以上三。这种物镜纠正了以上三种物镜的缺陷，校正了像场弯曲，不存在种物镜的缺陷，校正了像场弯曲，不存在视野中心与边缘不能同时准焦的现像。由视野中心与边缘不能同时准焦的现像。由于影像展开，在同样倍数下，影像要比一于影像展开，在同样倍数下，影像要比一般物镜的影像大。平场消色差物镜有多种般物镜的影像大。平场消色差物镜有多种类型，外壳上刻有类型，外壳上刻有plan.Apo。平场复消色。平场复消色差物镜是最佳物镜。差物镜是最佳物镜。物镜标识物镜标识n n物镜色差程度：物镜色差程度：Apo(复消色差物镜复消色差物镜)Fl(荧石物荧石物镜镜)plan 或或pl(平场消色差物镜平场消色差物镜)。n n放大倍数放大倍数/数字孔径：数字孔径：2.5，4（5），），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。n n标准机械筒长：标准机械筒长：160mm或或170mm。n n盖玻片厚：盖玻片厚：0.17mm，常以，常以170mm/0.17mm表示，载玻片厚小于表示，载玻片厚小于1.2mm。n n物镜与被检样品的介质：干燥系物镜无标志；物镜与被检样品的介质：干燥系物镜无标志；油浸镜标有油浸镜标有OIL、OEL、HL或或IMM字样；水浸字样；水浸镜标为镜标为W；甘油为；甘油为Glyz。目镜目镜(eyepiece)n n目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。目镜由二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。目镜由二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。目镜由二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。目镜由两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的 中间像就中间像就中间像就中间像就落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目镜外相交，这个相交点称为眼点（镜外相交，这个相交点称为眼点（镜外相交，这个相交点称为眼点（镜外相交，这个相交点称为眼点（eyepointeyepoint）。观）。观）。观）。观察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像晃动和不适的感觉，影响观察效果。晃动和不适的感觉，影响观察效果。晃动和不适的感觉，影响观察效果。晃动和不适的感觉，影响观察效果。目镜目镜(eyepiece)n n由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或CCDCCD）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一般在般在般在般在2.52.56.76.7倍之间。照相目镜外侧或端面刻有倍之间。照相目镜外侧或端面刻有倍之间。照相目镜外侧或端面刻有倍之间。照相目镜外侧或端面刻有“PHOTOPHOTO”、“FKFK”、“NFKNFK”字样。字样。字样。字样。目镜与物镜的组合目镜与物镜的组合物镜放大倍数物镜放大倍数10104040100100物镜数值孔径物镜数值孔径0.250.250.650.651.251.25有效放大倍数有效放大倍数125125250250325 325 650650625 625 12501250目镜放大倍数目镜放大倍数12.512.525258 8 16166 6 12.512.5 显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径的5001000倍。目镜与物镜组合前提是使放大倍数在有效放大率范围内。在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合目镜和物镜的组合n n当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。n n当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数时，所得放大倍数叫时，所得放大倍数叫时，所得放大倍数叫时，所得放大倍数叫“空的放大空的放大空的放大空的放大”，影像，影像，影像，影像细节的分辩能力没有提高。细节的分辩能力没有提高。细节的分辩能力没有提高。细节的分辩能力没有提高。在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用辩能力和清晰度，必须使用辩能力和清晰度，必须使用辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜高数值孔径的物镜高数值孔径的物镜高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合和低倍目镜的组合和低倍目镜的组合和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合目镜和物镜的组合n n例如数值孔径为例如数值孔径为例如数值孔径为例如数值孔径为1.31.3的物镜（标记为的物镜（标记为的物镜（标记为的物镜（标记为100/1.3100/1.3）与放大倍数为）与放大倍数为）与放大倍数为）与放大倍数为4 4的目镜组合，的目镜组合，的目镜组合，的目镜组合，总放大倍数为总放大倍数为总放大倍数为总放大倍数为400400，若入射光为绿色光，若入射光为绿色光，若入射光为绿色光，若入射光为绿色光（550550纳米），分辩力为纳米），分辩力为纳米），分辩力为纳米），分辩力为270270纳米。纳米。纳米。纳米。n n数值孔径为数值孔径为数值孔径为数值孔径为0.650.65的物镜（标记为的物镜（标记为的物镜（标记为的物镜（标记为40/0.6540/0.65）与放大倍数为）与放大倍数为）与放大倍数为）与放大倍数为1010的目镜组合，的目镜组合，的目镜组合，的目镜组合，总放大倍数为总放大倍数为总放大倍数为总放大倍数为400400，550550纳米时分辩力纳米时分辩力纳米时分辩力纳米时分辩力为为为为500500纳米。纳米。纳米。纳米。n n 两种组合结果，显然第一种能提高物像两种组合结果，显然第一种能提高物像两种组合结果，显然第一种能提高物像两种组合结果，显然第一种能提高物像分辩力。分辩力。分辩力。分辩力。不同照像目镜不同照像目镜/物镜组合的效果物镜组合的效果照像目镜的选择：在物镜的有效放大倍率内，尽量优选低倍照像目镜。聚光器聚光器(condenser)n n聚光器的主要作用是使光线集中于标本，聚光器的主要作用是使光线集中于标本，配合物镜提高物像的分辩力。配合物镜提高物像的分辩力。聚光镜聚光镜：聚光镜由一至数片透镜组成。：聚光镜由一至数片透镜组成。聚光镜有聚光作用，它的数值孔径在聚光镜有聚光作用，它的数值孔径在0.251.40不等，聚光镜的数值孔径不等，聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制。受孔径光阑控制。孔径光阑孔径光阑：孔径光阑的开放与收缩，：孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小，使图像调节聚光镜数值孔径的大小，使图像分辩力、反差和焦深处在最佳状态。分辩力、反差和焦深处在最佳状态。n n显微镜的功能主要取决于物镜的性能，而显微镜的功能主要取决于物镜的性能，而物镜的性能又取决于物镜的数值孔径，物物镜的性能又取决于物镜的数值孔径，物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。但显两者孔径相等时，物镜分辨力最高。但显微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是影像反差小、焦深浅，这两点可随孔径光影像反差小、焦深浅，这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物镜的分辩力的亮度降低，但影孔径时，物镜的分辩力的亮度降低，但影像反差和焦点深度提高，使影像更加清晰。像反差和焦点深度提高，使影像更加清晰。所以，在不过多降低分辩力前提下，要将所以，在不过多降低分辩力前提下，要将孔径光阑数值调到所用物镜数值孔径的孔径光阑数值调到所用物镜数值孔径的6080。物镜有效数值孔径物镜有效数值孔径(物镜物镜NA+聚光镜聚光镜NA)/2注注注注 意意意意若显微摄影的照明光线过强，可以改变灯的亮度（降若显微摄影的照明光线过强，可以改变灯的亮度（降若显微摄影的照明光线过强，可以改变灯的亮度（降若显微摄影的照明光线过强，可以改变灯的亮度（降低电压），用深色滤光片或增加滤光片的数目。千万低电压），用深色滤光片或增加滤光片的数目。千万低电压），用深色滤光片或增加滤光片的数目。千万低电压），用深色滤光片或增加滤光片的数目。千万不要改变聚光器的位置或缩小光圈，否则会降低显微不要改变聚光器的位置或缩小光圈，否则会降低显微不要改变聚光器的位置或缩小光圈，否则会降低显微不要改变聚光器的位置或缩小光圈，否则会降低显微镜的分辩力。镜的分辩力。镜的分辩力。镜的分辩力。若被检物为活体标本或未染色标本时，应缩小孔径光若被检物为活体标本或未染色标本时，应缩小孔径光若被检物为活体标本或未染色标本时，应缩小孔径光若被检物为活体标本或未染色标本时，应缩小孔径光阑，加强明暗对比。但为了防止物镜的分辩力的降低，阑，加强明暗对比。但为了防止物镜的分辩力的降低，阑，加强明暗对比。但为了防止物镜的分辩力的降低，阑，加强明暗对比。但为了防止物镜的分辩力的降低，必须加强照明光线的强度，但孔径光阑数值一般不能必须加强照明光线的强度，但孔径光阑数值一般不能必须加强照明光线的强度，但孔径光阑数值一般不能必须加强照明光线的强度，但孔径光阑数值一般不能小于物镜孔径光阑数值的小于物镜孔径光阑数值的小于物镜孔径光阑数值的小于物镜孔径光阑数值的6060。若聚光器外方没有刻度时，可以在标本调焦后，取下若聚光器外方没有刻度时，可以在标本调焦后，取下若聚光器外方没有刻度时，可以在标本调焦后，取下若聚光器外方没有刻度时，可以在标本调焦后，取下目镜，眼睛离目镜头目镜，眼睛离目镜头目镜，眼睛离目镜头目镜，眼睛离目镜头5 51010厘米，左眼观察镜筒，边厘米，左眼观察镜筒，边厘米，左眼观察镜筒，边厘米，左眼观察镜筒，边看物镜的后焦点平面，边缓慢增大孔径光阑，至物镜看物镜的后焦点平面，边缓慢增大孔径光阑，至物镜看物镜的后焦点平面，边缓慢增大孔径光阑，至物镜看物镜的后焦点平面，边缓慢增大孔径光阑，至物镜后透镜呈一明亮园时再将孔径光阑适当缩小（估计其后透镜呈一明亮园时再将孔径光阑适当缩小（估计其后透镜呈一明亮园时再将孔径光阑适当缩小（估计其后透镜呈一明亮园时再将孔径光阑适当缩小（估计其为物镜孔径数值的为物镜孔径数值的为物镜孔径数值的为物镜孔径数值的2/32/3），然后放回目镜。），然后放回目镜。），然后放回目镜。），然后放回目镜。视场光阑视场光阑n n 视场光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径，它根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积。视场光阑过小，视野亮度不足，影像不清晰；视场光阑过大，光束直径超出孔径光阑，造成光线的乱反射，也影响影像的清晰度。n n一般观察时，应先用聚光器上的调中一般观察时，应先用聚光器上的调中螺旋把视场光阑调到视场中心位置，螺旋把视场光阑调到视场中心位置，然后让视场光阑多边形光阑处于视场然后让视场光阑多边形光阑处于视场的外切位。的外切位。n n显微摄影时，视场光阑收缩至取景框显微摄影时，视场光阑收缩至取景框边缘的外方（但不能接触取景框），边缘的外方（但不能接触取景框），此位可使图像反差得到改善。如果视此位可使图像反差得到改善。如果视场光阑收缩得过于接近取景框时，则场光阑收缩得过于接近取景框时，则图像的四角将被切去。因为实际拍摄图像的四角将被切去。因为实际拍摄的视场范围要比取景框略大一些。的视场范围要比取景框略大一些。视场光阑的配合使用视场光阑的配合使用根据不同倍率物镜给予不同直径的光束；避免散射光，增加图像反差；适度：视场光阑像恰在取景框的外缘。过于接近或超过则会将图像的四角切掉。视场光阑配合使用视场光阑配合使用光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数n n分辨率分辨率：显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率”。其计算公式是=/N