《昆虫病毒》PPT课件.ppt

第七章第七章 昆虫病毒昆虫病毒地球上的昆虫可能达地球上的昆虫可能达10001000多万种，约占地球生物多样性多万种，约占地球生物多样性的一半，已命名的约的一半，已命名的约100100万种。万种。中国估计有中国估计有60-10060-100万种，但已记载的只万种，但已记载的只7 7万种左右。万种左右。第八章第八章 昆虫病毒昆虫病毒一、昆虫病毒的研究一、昆虫病毒的研究二、昆虫病毒的类型二、昆虫病毒的类型三、三、昆虫病毒的一般特性昆虫病毒的一般特性四、昆虫病毒对有益昆虫的危害四、昆虫病毒对有益昆虫的危害五、五、杆状病毒杆状病毒(Baculovirus)一、一、昆虫病毒的研究高尚荫高尚荫(1909-1989)(1909-1989)中国科学院中国科学院院士，病毒学家从事院士，病毒学家从事TMVTMV、流感、流感病毒、昆虫病毒等研究病毒、昆虫病毒等研究中国科学院院士中国科学院院士朱既明医学病毒学家朱既明医学病毒学家田波植物病毒学家田波植物病毒学家谢联辉植物病毒学家谢联辉植物病毒学家毛江森医学病毒学家毛江森医学病毒学家裘维藩裘维藩(1912-(1912-2000)2000)中国科学中国科学院院士，植物病院院士，植物病理学家，北京农理学家，北京农业大学教授，完业大学教授，完成中国第一部成中国第一部植物病毒学植物病毒学专著专著研究昆虫病毒的意义研究昆虫病毒的意义茶树害虫的幼虫、蛹、成虫和卵茶树害虫的幼虫、蛹、成虫和卵小菜粉蝶小菜粉蝶(菜青虫菜青虫)昆虫病毒的种类繁多，涉及昆虫病毒的种类繁多，涉及11个目的个目的900多种昆虫，多种昆虫，据统计我国已经发现的昆虫病毒有据统计我国已经发现的昆虫病毒有200余株。余株。二、昆虫病毒的类型二、昆虫病毒的类型根据根据根据根据“Virus taxanomy1999”“Virus taxanomy1999”“Virus taxanomy1999”“Virus taxanomy1999”，昆虫病毒可分为，昆虫病毒可分为，昆虫病毒可分为，昆虫病毒可分为7 7 7 7个个个个科科科科:1 1、杆状病毒科（、杆状病毒科（BaculoviridaeBaculoviridae）核型多角体病毒属（核型多角体病毒属（NucleopolyhedrovirusNucleopolyhedrovirus）颗粒体病毒属（颗粒体病毒属（GranulovirusGranulovirus）2 2、呼肠孤病毒科（、呼肠孤病毒科（ReoviridaeReoviridae）质型多角体病毒属（质型多角体病毒属（CypovirusCypovirus）3 3、痘病毒科（、痘病毒科（PoxviridaePoxviridae）昆虫痘病毒亚科（昆虫痘病毒亚科（EntomopoxvirinaeEntomopoxvirinae）4 4、细小病毒科（、细小病毒科（ParvoviridaeParvoviridae）浓核病毒亚科（浓核病毒亚科（DensovirunaeDensovirunae）5 5、虹彩病毒科（、虹彩病毒科（IridoviridaeIridoviridae）虹彩病毒属（虹彩病毒属（IridovirusIridovirus）6 6、弹状病毒科（、弹状病毒科（RhabdoviridaeRhabdoviridae）西格马病毒属（西格马病毒属（SigmavirusSigmavirus）7 7、微核糖核酸病毒科（、微核糖核酸病毒科（PicornaviridaePicornaviridae）肠道病毒属（肠道病毒属（EntervirusEntervirus）二、昆虫病毒的类型二、昆虫病毒的类型属于属于1313个病毒科、个病毒科、2 2个病毒亚科、个病毒亚科、2121个病毒属个病毒属。病毒核酸的类型分为：病毒核酸的类型分为：DNADNADNADNA病毒病毒病毒病毒dsDNAdsDNAdsDNAdsDNA病毒病毒病毒病毒，包括包括:杆状病毒科杆状病毒科；多分多分DNADNA病毒科；病毒科；痘病毒科；痘病毒科；泡囊病毒科；泡囊病毒科；虹彩病毒科。虹彩病毒科。DNADNADNADNA病毒病毒病毒病毒ssDNAssDNAssDNAssDNA病毒病毒病毒病毒包括细小病毒科。包括细小病毒科。DNADNADNADNA和和和和RNARNARNARNA反转录病毒反转录病毒反转录病毒反转录病毒，包括，包括:前病毒科：前病毒科：变位病毒科。变位病毒科。RNARNARNARNA病毒病毒病毒病毒dsRNAdsRNAdsRNAdsRNA病毒病毒病毒病毒，包括，包括:呼肠孤病毒科：呼肠孤病毒科：二分二分RNARNA病毒科病毒科RNARNARNARNA病毒病毒病毒病毒ssRNAssRNAssRNAssRNA病毒病毒病毒病毒，包括，包括:微微RNARNA病毒科；病毒科；野田村病毒科；野田村病毒科；T4T4病毒科病毒科三、昆虫病毒的一般特性三、昆虫病毒的一般特性(1)(1)大多数昆虫病毒能形成包含体，病毒粒子封闭大多数昆虫病毒能形成包含体，病毒粒子封闭在包含体中在包含体中,包含体的主要成分是蛋白质。包含体的主要成分是蛋白质。包含体的特性：包含体的特性：在许多在许多有机溶剂中不溶解有机溶剂中不溶解（酒精、乙醚、氯仿、（酒精、乙醚、氯仿、苯和丙酮），苯和丙酮），对蛋白酶抗性强对蛋白酶抗性强，但它们溶解于，但它们溶解于碳酸钠、氢氧化钠、氨的水溶液中。碳酸钠、氢氧化钠、氨的水溶液中。在自然条件下比较在自然条件下比较稳定稳定，落到土壤中的包含体，落到土壤中的包含体病毒能保持活性多年病毒能保持活性多年对对高温敏感高温敏感，对阳光和紫外线也缺乏抵抗力，对阳光和紫外线也缺乏抵抗力，一般的消毒剂也可使包含体病毒失活。一般的消毒剂也可使包含体病毒失活。根据包含体在寄主细胞中的部位，分为：根据包含体在寄主细胞中的部位，分为：核型多角体病毒核型多角体病毒(NPV，nuclear polyhedrosis virus)：寄生在寄主细胞核内，包含体内含有多个杆状病毒粒子。寄生在寄主细胞核内，包含体内含有多个杆状病毒粒子。质型多角体病毒质型多角体病毒(CPV,cytoplasmic polyhedrosis virus)：寄生在寄主细胞质中，包含体内含有多个球状病毒粒子。寄生在寄主细胞质中，包含体内含有多个球状病毒粒子。颗粒体病毒颗粒体病毒(GV，granulosis virus)：在感染的细胞核里和细胞质里均可发育形成。多为椭圆形，在感染的细胞核里和细胞质里均可发育形成。多为椭圆形，也有肾形。每个包含体一般仅含一个杆状病毒粒子。也有肾形。每个包含体一般仅含一个杆状病毒粒子。无包含体病毒无包含体病毒：如昆虫浓核病毒，感染病毒的宿主细胞核膨大，核内物质如昆虫浓核病毒，感染病毒的宿主细胞核膨大，核内物质呈浓密、丰盈现象。呈浓密、丰盈现象。昆虫痘病毒（昆虫痘病毒（Vagoiavirus）:椭圆形与纺锤形包涵体存在于椭圆形与纺锤形包涵体存在于细胞质内，但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的细胞质内，但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的.(2)昆虫病毒主要是通过口器感染昆虫病毒主要是通过口器感染(3)有些昆虫是植物病毒的介体，一般对介体有些昆虫是植物病毒的介体，一般对介体 昆虫无害昆虫无害(4)昆虫病毒可用于害虫的生物防治昆虫病毒可用于害虫的生物防治优点：缺点：（1）宿主特异高宿主特异高 能杀灭害虫，而不影响害虫的天敌，引起主要害虫的再猖獗与次要害虫上升等可能性较小；（2）不会污染环境，对人畜安全不会污染环境，对人畜安全 昆虫病毒是自然界本来存在的，特别杆状病毒（核型多角体病毒与颗粒体病毒）对河虾、牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物也无任何中毒性、致病性或异常变态反应；（3）后效作用明显后效作用明显 不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，而且有些情况下，病毒还可经卵传染，杀灭次代害虫，化学农药无此特点。（4）生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广三、昆虫病毒的一般特性三、昆虫病毒的一般特性昆虫病毒可用于害虫的生物防治昆虫病毒可用于害虫的生物防治中科院武汉病毒所研究成功中科院武汉病毒所研究成功 生物导弹生物导弹 新技术，新技术，防治松毛虫获得成功。防治松毛虫获得成功。利用利用卵寄生赤眼蜂卵寄生赤眼蜂特有的行为特点，结合昆虫病特有的行为特点，结合昆虫病毒流行病学规律，通过卵寄生蜂将经过高新技术毒流行病学规律，通过卵寄生蜂将经过高新技术处理的强毒力病毒制剂传递到靶害虫卵表面，使处理的强毒力病毒制剂传递到靶害虫卵表面，使初孵幼虫罹病死亡。初孵幼虫罹病死亡。既能有效地既能有效地控制害虫控制害虫大发生，又可以大发生，又可以保护天敌保护天敌，不污染环境不污染环境，对人畜，对人畜安全无害安全无害。三、昆虫病毒的一般特性三、昆虫病毒的一般特性“生物导弹生物导弹”以卵寄生蜂为媒介传递病毒防治害虫以卵寄生蜂为媒介传递病毒防治害虫,用用柞蚕卵来繁殖柞蚕卵来繁殖赤眼蜂赤眼蜂,并将研制的适应赤眼蜂携带的病毒剂型均匀地并将研制的适应赤眼蜂携带的病毒剂型均匀地雾化喷洒在柞蚕卵表面。当赤眼蜂咬破壳从蚕壳爬出雾化喷洒在柞蚕卵表面。当赤眼蜂咬破壳从蚕壳爬出来时来时,每个蜂身上可粘上每个蜂身上可粘上数百数百个病毒。赤眼蜂能迅速准个病毒。赤眼蜂能迅速准确地找到害虫卵作为寄生卵确地找到害虫卵作为寄生卵,贴近害虫卵壳的同时贴近害虫卵壳的同时,病病毒粘到卵壳上毒粘到卵壳上,使害虫种群发生病毒性流行病。使害虫种群发生病毒性流行病。只用只用5枚生物导弹就可控制一亩地范围的松毛虫流行枚生物导弹就可控制一亩地范围的松毛虫流行;持续期长持续期长,一次防治多年受益一次防治多年受益。实施方法简单实施方法简单：将半个火柴盒大小的将半个火柴盒大小的“生物导弹生物导弹”挂在挂在树木一人高处。树木一人高处。昆虫病毒生产过程昆虫病毒生产过程斜纹夜蛾病毒杀虫剂及甜菜夜蛾病毒斜纹夜蛾病毒杀虫剂及甜菜夜蛾病毒杀虫剂：一种核型多角体病毒（杀虫剂：一种核型多角体病毒（NPV）饲养昆虫饲养昆虫病毒感染病毒感染收集病毒收集病毒病毒杀虫剂生产工艺病毒杀虫剂生产工艺（以（以NPV杀虫剂为例）杀虫剂为例）病毒杀虫剂病毒杀虫剂生产工艺生产工艺（以（以NPV杀虫剂为例）杀虫剂为例）五、杆状病毒五、杆状病毒(Baculovirus)有包膜的超大双链闭合环状有包膜的超大双链闭合环状DNA病毒病毒(135k bp)分类上独立为杆状病毒科分类上独立为杆状病毒科(Baculovidae),分分3个属：个属：多角体病毒属多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)颗粒体病毒属颗粒体病毒属(Granulovirus)非包埋杆状病毒属非包埋杆状病毒属(Nonoccluded Baculoviruses)目前至少从目前至少从600多种昆虫和其他无脊椎动物中发现多种昆虫和其他无脊椎动物中发现各种病毒的感染各种病毒的感染调节种群密度调节种群密度感染病毒的幼虫形成大量包含体，扩散、传播感染病毒的幼虫形成大量包含体，扩散、传播杆状病毒有宿主专一性，对脊椎动物、植物完全不杆状病毒有宿主专一性，对脊椎动物、植物完全不感染感染应用安全应用安全主要见于昆虫体内，是已知昆虫病毒中类群最大、主要见于昆虫体内，是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多，且实用意义最大的。发现最早、研究最多，且实用意义最大的。主要应用主要应用:作为载体，表达外源基因作为载体，表达外源基因;作为杀虫剂，有效地控制农业害虫的发生，并作为杀虫剂，有效地控制农业害虫的发生，并且对环境不造成污染。且对环境不造成污染。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedorosis Virus,AcMNPV)研究得最深入。研究得最深入。五、杆状病毒五、杆状病毒(Baculovirus)形态特征：形态特征：包含体：包含体：核多角体、颗粒体核多角体、颗粒体病毒粒子病毒粒子:有包膜、产生有包膜、产生2种：芽生型种：芽生型bubed（早期）和包埋型（早期）和包埋型occluded（晚期）（晚期）病理学特征：病理学特征：病理学特征：病理学特征：宿主仅限于节肢动物宿主仅限于节肢动物动作迟缓、食欲减退、虫体肿胀，轻触即破，动作迟缓、食欲减退、虫体肿胀，轻触即破，流出浓汁（无臭），倒悬而死。流出浓汁（无臭），倒悬而死。可入侵中肠组织、进入血淋巴及其他组织可入侵中肠组织、进入血淋巴及其他组织从感染到死亡需从感染到死亡需57d。五、杆状病毒五、杆状病毒(Baculovirus)昆虫杆状病毒表达载体系统昆虫杆状病毒表达载体系统 Baculovirus Expression Vector System，BEVS80S初，国外学者发现初，国外学者发现多角体蛋白基因多角体蛋白基因（polh)的的强启动子强启动子及及晚期大量表达晚期大量表达的特性，的特性，Smith等首次建立了等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞秋黏虫细胞表达系统表达系统，表达了人，表达了人干扰素。干扰素。从此，以杆状病毒作为载体，在昆虫细胞从此，以杆状病毒作为载体，在昆虫细胞或虫体内表达外源基因，形成了或虫体内表达外源基因，形成了BEVS。五、杆状病毒五、杆状病毒早期的早期的BEVS有很多不足，如：有很多不足，如：重组率较低重组率较低 筛选困难筛选困难 操作周期长操作周期长 产物不易纯化等产物不易纯化等短短短短20多年时间里，随着杆状病毒分子生物学研多年时间里，随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入，杆状病毒表达系统迅速发展，不究的不断深入，杆状病毒表达系统迅速发展，不断完善，已成为当今基因工程领域四大表达系统断完善，已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，在研究之一，在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能基因表达调控、蛋白质结构和功能分析分析及各种及各种生物活性物质的制备生物活性物质的制备等方面发挥着越等方面发挥着越来越重要的作用。来越重要的作用。五、杆状病毒五、杆状病毒构构 成成通常通常通常通常BEVSBEVS由由由由转移载体转移载体转移载体转移载体、亲本病毒亲本病毒亲本病毒亲本病毒和和和和重组介质重组介质重组介质重组介质三三三三部分组成，其技术路线分以下几步：部分组成，其技术路线分以下几步：部分组成，其技术路线分以下几步：部分组成，其技术路线分以下几步：先将先将先将先将外源片段外源片段外源片段外源片段克隆到载体克隆到载体克隆到载体克隆到载体质粒质粒质粒质粒中，置于杆状病毒中，置于杆状病毒中，置于杆状病毒中，置于杆状病毒启动子控制启动子控制启动子控制启动子控制之下之下之下之下，上下游上下游上下游上下游各有一段与亲本病毒各有一段与亲本病毒各有一段与亲本病毒各有一段与亲本病毒DNADNA相匹配的相匹配的相匹配的相匹配的侧翼序列侧翼序列侧翼序列侧翼序列（flanking flanking secquencesecquence)，构建成转移载体构建成转移载体构建成转移载体构建成转移载体；把转移载体把转移载体把转移载体把转移载体和野生型病毒共转染和野生型病毒共转染和野生型病毒共转染和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通入昆虫细胞，通入昆虫细胞，通入昆虫细胞，通过过过过同源重组同源重组同源重组同源重组将外源片段插入到病毒基因组，再以将外源片段插入到病毒基因组，再以将外源片段插入到病毒基因组，再以将外源片段插入到病毒基因组，再以特定的筛选标记和方法特定的筛选标记和方法特定的筛选标记和方法特定的筛选标记和方法获得重组病毒获得重组病毒获得重组病毒获得重组病毒。最后最后最后最后空斑纯化空斑纯化空斑纯化空斑纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化所表达的外源蛋白。所表达的外源蛋白。所表达的外源蛋白。所表达的外源蛋白。五、杆状病毒五、杆状病毒优势优势（与细菌、（与细菌、酵母、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比）：哺乳动物细胞表达系统相比）：多角体基因启动子下的多角体基因启动子下的多角体基因启动子下的多角体基因启动子下的超高表达效率超高表达效率超高表达效率超高表达效率；表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白使蛋白使蛋白使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性产物保持天然结构、生物活性和免疫活性产物保持天然结构、生物活性和免疫活性产物保持天然结构、生物活性和免疫活性；可可可可同时表达多个外源蛋白同时表达多个外源蛋白同时表达多个外源蛋白同时表达多个外源蛋白，来源遍及动物、植物、来源遍及动物、植物、来源遍及动物、植物、来源遍及动物、植物、细菌真菌和病毒；细菌真菌和病毒；细菌真菌和病毒；细菌真菌和病毒；能能能能容纳较大的外源基因容纳较大的外源基因容纳较大的外源基因容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；而不影响其本身的增殖；而不影响其本身的增殖；而不影响其本身的增殖；蛋白蛋白蛋白蛋白产物易产物易产物易产物易从无血清的培养上清中从无血清的培养上清中从无血清的培养上清中从无血清的培养上清中纯化纯化纯化纯化，无无无无内毒素内毒素内毒素内毒素污染；污染；污染；污染；生物生物生物生物安全性高安全性高安全性高安全性高，对植物和脊椎动物均无致病性，而，对植物和脊椎动物均无致病性，而，对植物和脊椎动物均无致病性，而，对植物和脊椎动物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱。界的生存能力很弱。界的生存能力很弱。界的生存能力很弱。五、杆状病毒五、杆状病毒 了解昆虫病毒的特点及其应用了解昆虫病毒的特点及其应用昆虫病毒昆虫病毒