生物化学经典实验——糖的定量测定(精品).ppt
实验一实验一 糖类的定量测定糖类的定量测定3，5-二硝基水杨酸比色定糖法二硝基水杨酸比色定糖法一、实验目的一、实验目的 1、掌握、掌握3,5-二硝基水杨酸法定糖的原理及方二硝基水杨酸法定糖的原理及方 法。法。2、用、用3,5-二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中总糖。总糖。3、熟悉分光光度计的原理及使用方法。、熟悉分光光度计的原理及使用方法。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。二、实验原理二、实验原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色棕红色的氨基化合物：的氨基化合物：在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利用与还原糖的量成正比。因此，我们可以利用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少。质干扰较少。三、实验操作三、实验操作 1、样品总糖的水解及提取、样品总糖的水解及提取 准确称取准确称取山芋粉山芋粉1克克，放入大试管中，加入，放入大试管中，加入10ml 6N HCl和和15ml蒸馏水蒸馏水，混匀。在沸水浴加，混匀。在沸水浴加热热30min后，用后，用KI-I2溶液检查水解程度。溶液检查水解程度。完全水解后完全水解后,冷却并加入酚酞试剂一滴冷却并加入酚酞试剂一滴,以以10%NaOH中和至溶液呈中和至溶液呈微红色微红色,先用双层纱布先用双层纱布过滤过滤,再用滤纸过滤并定容至再用滤纸过滤并定容至100ml。精确吸取上精确吸取上述溶液述溶液10ml放入放入100ml容量瓶、稀释至刻度容量瓶、稀释至刻度,备用。备用。2、制作葡萄糖标准曲线、制作葡萄糖标准曲线项项 目目 空白空白 123456葡萄糖液葡萄糖液(ml）00.40.60.81.01.21.4蒸馏水蒸馏水（ml）2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂试剂(m1)1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加加 热热 均在沸水浴中加热均在沸水浴中加热5min 冷冷 却却 立即用流动冷水冷却立即用流动冷水冷却 蒸馏水蒸馏水(ml)21.5 21.5 21.521.521.521.521.5光光 密密 度度(O.D520nm)将以上各管溶液混匀后，用分光光度计将以上各管溶液混匀后，用分光光度计(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点，进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出标准曲线。度为纵坐标，绘制出标准曲线。3、样品中含糖量的测定、样品中含糖量的测定 取取4支大试管，分别按下表加入各种试剂。支大试管，分别按下表加入各种试剂。2、制作葡萄糖标准曲线、制作葡萄糖标准曲线测定样品中含糖量时各试剂的用量测定样品中含糖量时各试剂的用量项项 目目 空白空白 123样品量样品量(ml）01.01.01.0蒸馏水蒸馏水（ml）2.01.01.01.0DNS试剂试剂(m1)1.5 1.5 1.5 1.5 加加 热热 均在沸水浴中加热均在沸水浴中加热5min 冷冷 却却 立即用流动冷水冷却立即用流动冷水冷却 蒸馏水蒸馏水(ml)21.5 21.5 21.521.5光光 密密 度度(O.D520)将各管混匀后将各管混匀后,按制作标准曲线时同样的操作测按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度定各管的光密度,在标准曲线上查出相应的糖含在标准曲线上查出相应的糖含量量,按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量。还原糖还原糖mg/ml提取液体积提取液体积稀释倍数稀释倍数总糖总糖=100样品重量样品重量3、样品中含糖量的测定、样品中含糖量的测定1.实验过程中所有的试管要干净实验过程中所有的试管要干净,加入各种试剂量加入各种试剂量要准确。要准确。2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。用后盖好瓶塞，防回原处。3.分光光度计使用分光光度计使用：溶液不要倒太多：溶液不要倒太多;毛边不要对毛边不要对着透光处着透光处;用后用自来水冲洗干净用后用自来水冲洗干净,防回原处。防回原处。4.移液管使用移液管使用：有色看外边缘：有色看外边缘,无色看中间凹处。无色看中间凹处。5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂瓶等，以防试剂污染仪器。试剂瓶等，以防试剂污染仪器。四、实验要求四、实验要求
