第5章 生化药物制造工艺(酶类药物)(精品).ppt

酶类药物酶的分类酶的分类酶类药物的提取和纯化酶类药物的提取和纯化 原料选择原料选择生物材料的预处理生物材料的预处理提取提取浓缩浓缩纯化纯化结晶结晶动物材料的预处理：动物材料的预处理：（1）机械法：）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法，有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法，有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其 他处理法。他处理法。（2）冻融：）冻融：冷到冷到-10左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。（3）丙酮粉：）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少 酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂 质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。材料的预处理材料的预处理 酶的浓缩酶的浓缩（1）工业上：）工业上：超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩冷冻浓缩（2）实验室：）实验室：除上述方法外，对少量样品可用下列方法除上述方法外，对少量样品可用下列方法 1.用用G-15或或G-25浓缩浓缩 2.用聚乙二醇浓缩用聚乙二醇浓缩注意两个问题：注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法建立快速的测定酶活力的方法 2.建立活力回收表建立活力回收表酶的纯化：酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表酶的结晶酶的结晶 特征：特征：有序性，对称排列，周期性的重复结构有序性，对称排列，周期性的重复结构 为空间结构研究提供为空间结构研究提供x-衍射样品衍射样品1.酶的结晶方法酶的结晶方法 缓慢改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。缓慢改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法）盐析法 （2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法 （3）复合结晶法）复合结晶法 （4）透析平衡法）透析平衡法 （5）等电点法）等电点法既是纯化的结果又是纯化的手段既是纯化的结果又是纯化的手段2.2.结晶的条件选择结晶的条件选择酶的纯度酶的纯度酶的浓度酶的浓度金属离子金属离子pH温度、时间温度、时间晶种晶种 酶的分离纯化工作中的注意事项酶的分离纯化工作中的注意事项1.1.防止酶蛋白变性防止酶蛋白变性2.2.防止复因子丢失防止复因子丢失3.3.防止酶被蛋白防止酶被蛋白 水解酶降解水解酶降解超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）结构特点：结构特点：金属酶金属酶Fe-SOD:Mw38000，2个亚基，每个亚基含个亚基，每个亚基含1个个Fe，存在，存在 于于 中中 Cu、Zn-SOD:Mw32000，2个亚基，每个亚基含个亚基，每个亚基含1个个Cu，1个个 Zn，存在于，存在于 中中Mn-SOD:原核细胞中，原核细胞中，Mw40000,2个亚基，每个亚基个亚基，每个亚基1个个Mn 真核细胞中，真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基个亚基，每个亚基1个个Mn真核细胞真核细胞原核细胞原核细胞酶的性质酶的性质稳定性稳定性 对热稳定：天然牛血对热稳定：天然牛血SOD可可75加热数分钟，对热加热数分钟，对热 稳定性与溶液离子强度有关稳定性与溶液离子强度有关 对对pH的稳定性：一般的稳定性：一般pH5.39.5较稳定，猪血较稳定，猪血SOD在在 pH7.69较稳定较稳定金属辅基与酶活性关系金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与催化活性无关与分子结构有关，与催化活性无关 Cu与活性有关，对酶活力是必需的与活性有关，对酶活力是必需的 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的对酶活力是必需的 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的对酶活力是必需的1.以牛血红细胞提取以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD的工艺的工艺2.以牛肝为原料提取以牛肝为原料提取Mn-SOD的工艺的工艺