微生物的遗传变异与育种课件.ppt

第十章第十章 微生物的遗传变异与育种微生物的遗传变异与育种 第一节第一节 遗传物质的物质基础遗传物质的物质基础l遗传遗传(heredity)：l亲代生物传递给子代一套实现与其相同亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。形状的遗传信息。l特点：具稳定性。特点：具稳定性。遗传型（遗传型（genotype）：）：又称基因型，指某一生物个体所含有的又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和全部基因的总和是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。l变异变异(variation):生生物物体体在在外外因因或或内内因因的的作作用用下下，遗遗传传物物质质的的结结构构或或数数量量发发生生改改变变而而导导致致表表型改变。型改变。变异的特点：变异的特点：a a。群体一般为。群体一般为1010-6-61010-10-10；b.b.形状变化的幅度大；形状变化的幅度大；c.c.变化后形成的新性状是稳定遗传的。变化后形成的新性状是稳定遗传的。表型（表型（phenotype）：）：指生物体所具有的一切外表特征指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和和内在特性的总和;是具一定遗传型的生物在一定是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。条件下所表现出的具体性状。遗传型遗传型+环境条件环境条件表型表型l。l饰变（饰变（modification）：指指不不涉涉及及遗遗传传物物质质结结构构改改变变而而只只发发生生在在转转录录、转译水平上的表型变化。转译水平上的表型变化。特点：特点：a.几几乎乎整整个个群群体体中中的的每每一一个个个个体体都都发发生生同同样样的变化；的变化；b.性状变化的幅度小；性状变化的幅度小；c.因因遗遗传传物物质质不不变变，故故饰饰变变是是不不遗遗传传的的。引引起饰变的因素消失后，表型即可恢复起饰变的因素消失后，表型即可恢复。一、一、3 个经典实验个经典实验（一）经典转化实验（二）噬菌体感染实验（三）植物病毒重建实验（一）经典转化实验（一）经典转化实验l1928年F.Griffith肺炎链球菌l使小鼠患败血症死亡lS型菌株-菌株形成荚膜、菌落表面光滑、致病lR型菌株-菌株不形成荚膜、菌落表面粗糙、不致病l平板培养实验平板培养实验热死热死S菌菌不生长不生长活活R菌菌长出长出RII菌菌热死热死S菌菌+活活R菌菌长出大量长出大量R菌和菌和10-菌菌l活活R R菌菌 +S+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液 长出大量长出大量R R菌和少量菌和少量S S菌菌 l 1944年年 O.T.Avery活活R菌菌+l加加S菌菌DNAl加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶l加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶l加加S菌的菌的RNAl加加S菌的蛋白质菌的蛋白质l加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖l长出长出S菌菌只长只长R菌菌10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培养沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整后，可产生大量完整的子代噬菌体的子代噬菌体（二）噬菌体感（二）噬菌体感染实验染实验含含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中l（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式l（一）核酸存在的七个水平及质粒（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或或RNA，复合或裸露，双链或单链，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录转录翻译翻译密码子水平：密码子水平：信息单位信息单位,起始和终止起始和终止,核苷酸水平：核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基突变或交换单位，四种碱基DNA的三种存在形式的三种存在形式第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变一、基因突变一、基因突变l突变：指生物体的表型发生的可突变：指生物体的表型发生的可遗传的变化遗传的变化。l狭义突变：基因突变点突变l广义突变：基因突变和染色体畸变l突变的几率：10-6-10-9l野生菌株-突变-突变株（一）基因突变类型（表型分类）（一）基因突变类型（表型分类）营养缺陷型（株）抗性突变型（株）条件致死突变（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）l营养缺陷型营养缺陷型因突变而丧失合成某种因突变而丧失合成某种物质的能力，因此必须在培养基中添物质的能力，因此必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。加某种物质才能生长的突变类型。l抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的突化学药物或致死物理因子的抗性的突变株。变株。l条件致死突变型条件致死突变型突变后在某种条突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型抗原突变型因突变而引起的抗原因突变而引起的抗原结构发生改变结构发生改变（二）突变率（二）突变率l每一细胞在每一世代中发生某一性状突每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。变的几率。l突变率为突变率为101088是指该细胞在一亿次细胞是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。分裂中，会发生一次突变。l突变率也可以用每一单位群体在每一世突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（代中产生突变株（mutantmutant，即突变型），即突变型）的数目来表示。的数目来表示。l突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数 ll突变是突变是独立的独立的。某一基因发生。某一基因发生突变突变不会影响其它基因不会影响其它基因的突变的突变率。率。（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点以细菌的抗药性为例。以细菌的抗药性为例。不不对对应应性性：突突变变的的性性状状与与突突变变原原因之间无直接的对应关系。因之间无直接的对应关系。自自发发性性：突突变变可可以以在在没没有有人人为为诱诱变因素处理下自发地产生。变因素处理下自发地产生。稀有性稀有性：突变率低且稳定。：突变率低且稳定。（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点独独立立性性：各各种种突突变变独独立立发发生生，不会互相影响。不会互相影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传：变异性状稳定可遗传。（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点可逆性：可逆性：从原始的野生型基因从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变过程则称为回复突变（四）基因突变的自发性和不对应性（四）基因突变的自发性和不对应性l变量试验又称波动试验或彷徨试验。变量试验又称波动试验或彷徨试验。l19431943年，年，S.E.S.E.LuriaLuria 和和M.M.DelbrckDelbrck 根据统计根据统计学原理，设计了的实验。学原理，设计了的实验。l大肠杆菌大肠杆菌 l大肠杆菌的大肠杆菌的T1T1噬菌体（烈性噬菌体）噬菌体（烈性噬菌体）l观察统计抗噬菌体的抗性菌株数量观察统计抗噬菌体的抗性菌株数量 l2、涂布实验、涂布实验原理与变量试验相同，方法更为简原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。便，且可计算突变率。l（五）基因突变剂机制（五）基因突变剂机制l自发突变l诱发突变1、染色体数目的变化染色体数目的变化 ln-2n-3n-4n整倍变化ln-n+1、n-1，2n-2n+1、2n-1、2n-2非整倍变化l原核生物只有一条染色体，但可成为部分二倍体。2、染色体结构的变化染色体结构的变化染色体结构的变化也称为染色体畸变，包括：缺失、重复、倒位、易位、转座。一般认为这是由于染色体单体发生断裂后，错误性愈合而造成的。可造成隐性基因的表达、显形基因的拷贝数增多、某一性状的缺失、基因间连锁程度的变化、不同染色体基因的连锁等变化。重复、缺失、倒位、易位转座因子（可移动基因、跳跃基因）转座因子（可移动基因、跳跃基因）l插入序列ISl转座子Tnl转座噬菌体Mnl转座频率：10-510-7ll转座因子-复制-非同源重组l正向重复序列-转座酶基因-反向重复序列l3、基因突变（点突变）的诱变机制、基因突变（点突变）的诱变机制l诱变剂（诱变剂（mutagenmutagen）：凡能提高突）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变率的任何理化因子，就称为诱变剂变剂 l种类：诱变剂的种类很多种类：诱变剂的种类很多 l代表性的诱变剂的作用机制。代表性的诱变剂的作用机制。l（1）碱基置换（substitution）一对碱基被另一对碱基所置换。一对碱基被另一对碱基所置换。转换（转换（transitiontransition），即），即DNADNA链中的一个嘌链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；啶所置换；颠换（颠换（transversiontransversion），即，即一个嘌呤被一个嘧啶一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换个嘌呤所置换。l碱基的置换（实线代表转换；碱基的置换（实线代表转换；虚线代表颠换）虚线代表颠换）碱基置换后会出现下列几种情况碱基置换后会出现下列几种情况(1)错错义义突突变变一一种种氨氨基基酸酸，变变成成另另一一种种氨基酸；氨基酸；l(2)无义突变无义突变氨基酸的碱基置换后变成氨基酸的碱基置换后变成lUAG（琥珀突变）、（琥珀突变）、lUAA（赫石突变）（赫石突变）lUGA（乳石突变）等终止密码子；（乳石突变）等终止密码子；l配对原则嘌呤嘌呤-嘧啶嘧啶6位上是氨基的嘌呤位上是氨基的嘌呤-4位上是酮基的嘧啶位上是酮基的嘧啶6位上是酮基的嘌呤位上是酮基的嘌呤-4位上是氨基的嘧啶位上是氨基的嘧啶*烷化剂烷化剂(alkylating agent)l带有一个或多个活性烷基，诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。l常见的烷化剂有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。B 间接引起置换的诱变剂l这类诱变剂主要是一些碱基类似物l这些化合物有这些化合物有5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU），），5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤(8-NG)和和2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP）等。）等。l它们与正常碱基的结构类似，在它们与正常碱基的结构类似，在DNA复制时，复制时，它们可以被错误地掺入它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。（2）移码突变）移码突变l移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。移码突变诱变剂移码突变诱变剂 l吖啶类染料（原黄素、吖啶黄、吖啶橙等）l和一系列称为ICR类的化合物（美国的肿瘤研究所合成而得名），都是移码突变的有效诱变剂4、自发突变的机理、自发突变的机理l大多数自发突变本质上也是诱发的，只不过它不是人为的，而是自然环境或细胞内环境诱发的。l细胞外因素、l细胞内因素lDNA分子内部因素（1）细胞外的诱发因素）细胞外的诱发因素 l自然环境或人工条件下的物理和化学因素l自然环境中，宇宙间的短波辐射、宇宙线和紫外线等，多因素低剂量长期辐射的综合效应，将会引起生物的自发突变。l自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料等都能成为引起生物突变的化学因素（2）细胞内的诱发因素）细胞内的诱发因素 l细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。l许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。l（3）DNA分子内部因素分子内部因素DNA分子中的碱基存在着互变异构效应。A、T、G、C四种碱基，存在酮基结构（T，G）或氨基结构（A，C），酮式与烯醇式存在互变异构，氨基式与亚氨基式存在互变状态（3）DNA分子内部因素分子内部因素l一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，lDNA两条互补链之间总是以A:T和CG碱基配对。l但T偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现，这样在DNA复制到达这一位置的瞬间，新合成链中T对应的不再是A，而是G；（3）DNA分子内部因素分子内部因素l同理，若碱基同理，若碱基C以稀有的亚氨基形式出现，以稀有的亚氨基形式出现，在在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是应的不是Gl据统计，碱基对发生自发突变的据统计，碱基对发生自发突变的几率约为几率约为108109。l环出效应环状突出效应。有人提出，在环状突出效应。有人提出，在DNA的复制过程中，如果其中某一单的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传其上的基因越过复制而发生遗传缺失缺失（六）紫外线对（六）紫外线对DNA的损伤及其修复的损伤及其修复l嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。成和消除。l紫外线的主要作用是使紫外线的主要作用是使同链同链DNA的相邻嘧的相邻嘧啶啶间间形成共价结合的形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体。1、光复活作用（photoreactivation）l经紫外线照射后的微生物立即暴露于经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。现象，称为光复活作用。对照：对照：8106个个/mlE.coliU.V.100个个/ml试验：试验：8106个个/mlE.coliU.V.360490nm2106个个/mlE.coli可见光，可见光，30分分l1、光复活作用（photoreactivation）l经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的体的DNA分子，在黑暗下会被一种分子，在黑暗下会被一种光激活光激活酶酶即光裂合酶（即光裂合酶（photolyase）结合，当形）结合，当形成的复合物暴露在可见光（成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。光激活酶也而使二聚体重新分解成单体。光激活酶也从复合物中释放出来。每一从复合物中释放出来。每一E.coli细胞中细胞中约含有约含有25个光激活酶分子个光激活酶分子。1、光复活作用（photoreactivation）l由于一般的微生物中都存在着光由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。理照射后的菌液。l2、暗修复作用（dark repair）l又称切除修复（又称切除修复（excisionrepair）。）。是活细胞内一种用于修复被紫外是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、线等诱变剂（包括烷化剂、X射线射线和和射线等）损伤后的射线等）损伤后的DNA的机制。的机制。这种修复作用与光无关。这种修复作用与光无关。l有四种酶参与有四种酶参与l内切核酸酶：切开内切核酸酶：切开l外切核酸酶外切核酸酶：扩大：扩大lDNA聚合酶：复制聚合酶：复制l通过通过连接酶：连接连接酶：连接l完成了修复作用。完成了修复作用。3、紫外诱变方法:设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，紫外灯：波长为紫外灯：波长为253、7nm,功率是功率是15W处理时的照射距离：处理时的照射距离：20cm30cm样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm照射时，要用照射时，要用磁力搅拌器搅拌。磁力搅拌器搅拌。处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。选择合适的剂量。生产上经常采用的剂量：生产上经常采用的剂量：死亡率为死亡率为70%80%左右。左右。l二、突变与育种二、突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种1、生产中育种、生产中育种10-6突变率突变率-寻找正向突变菌株寻找正向突变菌株2、定向培育优良菌种、定向培育优良菌种牛型结核杆菌牛型结核杆菌-13年年-230代代-卡卡介苗（减毒活菌疫苗）介苗（减毒活菌疫苗）（二）诱变育种（二）诱变育种诱变+筛选诱变是随机的；筛选是定向的目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。1、诱变育种的基本规律、诱变育种的基本规律2、诱变育种中的几个原则、诱变育种中的几个原则诱变剂的选择诱变剂的选择 1诱变剂作用的普遍性：选择那些在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。如：UV，亚硝基胍（NTG），快中子等。2诱变剂的特异性：经验之谈。如，四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺，青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍3*菌株的差异：（即使是同一菌）A：遗传性不稳定的菌株-用缓和诱变剂B：遗传性稳定的菌株-首用强，后用缓。*考虑诱变机制：UV嘧啶，亚硝酸嘌呤，因此复合用为好2、诱变育种中的几个原则、诱变育种中的几个原则诱变基本过程诱变基本过程ll选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛选筛选筛选 保藏和扩大试验保藏和扩大试验出出发菌株的菌株的选择 出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：（4）.制备单细胞或单孢子悬液要求 菌体处于对数生长期，细胞分散且为单细胞，方法：玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80 用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂生理盐水 化学诱变剂缓冲液 浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml（5）诱变剂剂量的选择诱变剂剂量的选择l用90-99%杀菌剂量l用5085%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株。（6）诱变剂的处理方法诱变剂的处理方法 诱变剂使用方式诱变剂使用方式单一处理单一处理复合处理：复合处理：诱变处理条件：温度（生长温度）诱变处理条件：温度（生长温度）PH（缓冲剂）（缓冲剂）处理时间处理时间诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释l（7）突变株的筛选突变株的筛选 筛选条件：基因型筛选条件：基因型+环境环境表型表型表型迟延表型迟延充分表达充分表达分离性迟延现象分离性迟延现象生理性迟延现象生理性迟延现象l（7）突变株的筛选突变株的筛选 合适的筛选方法合适的筛选方法：平皿快速检测法平皿快速检测法变色圈法变色圈法透明圈法透明圈法生长圈法生长圈法抑菌圈法抑菌圈法梯度平板法梯度平板法摇瓶培养法摇瓶培养法第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株选出选出50株株选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）3、三类突变株的筛选、三类突变株的筛选l产量突变株筛选 l l抗药性突变株的筛选（梯度平板法）l l营养缺陷型(auxotroph)的筛选 l 产量突变株筛选产量突变株筛选琼脂块培养法（春日霉素）孢子悬液-诱变-适当培养（表型迟延）-涂布平板-打孔取菌落-琼脂块培养-4-5天测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈-效价高菌 抗药性突变株的筛选（梯度平板法）抗药性突变株的筛选（梯度平板法）抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：*作作为菌株的菌株的遗传标记*作作为生生产菌种菌种（结构构类似物抗性似物抗性突变突变株株）如如“吡哆醇高产菌株的筛选吡哆醇高产菌株的筛选”营养缺陷型营养缺陷型(auxotrophauxotroph)的筛选的筛选A：有关的三类遗传型个体：有关的三类遗传型个体：营养缺陷型养缺陷型突变株突变株：必必须在培养基内加入相在培养基内加入相应有机养分有机养分野生型野生型菌株菌株：自然界分离到的任何微生物，在其自然界分离到的任何微生物，在其发生生营养缺陷突养缺陷突变前的原始菌株，前的原始菌株，为该微生物的野生型。微生物的野生型。原养型菌株原养型菌株：指指营养缺陷型突养缺陷型突变菌株回复突菌株回复突变或重或重组后后产生的菌生的菌株，与野生型的表型相同。株，与野生型的表型相同。l有关的三类培养基有关的三类培养基l基本培养基基本培养基（MM）-：凡是能凡是能满足野生型菌株足野生型菌株营养要养要求求的的最低成分的最低成分的合成培养基合成培养基。l完全培养基完全培养基（CM）+：满足一切足一切营养缺陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的天然或半的天然或半合成合成培养基。培养基。l补充培养基充培养基（SM）x：在：在MM中有中有针对性地加入一或性地加入一或几种几种营养成分以养成分以满足相足相应营养缺陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的的合成合成培培养基。养基。筛选步骤筛选步骤野生型菌株C-1：诱变处理（同前讲述）lC-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）lC-3：检出缺陷型lC-4：鉴定缺陷型C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）：淘汰野生型（浓缩缺陷型）l诱变后，仍存在大量的野生型，不利于分离l（1）抗生素法）抗生素法l野生型菌株在MM上生长+青霉素杀死l缺陷型菌株在MM上不生长青霉素-不杀死注意：使环境的渗透压提高，避免细胞破裂。抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液l制霉菌素法则适合于真菌（例如：酵母、霉菌），可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起溶菌（2）菌菌丝过滤法法适于：适于：丝状（放状（放线菌、霉菌）菌、霉菌）原理：原理：野生型基本培养基上野生型基本培养基上发育成菌育成菌丝；缺缺陷型陷型孢子子不萌发不萌发可通可通过滤膜，野生型菌膜，野生型菌丝不能通不能通过。l检出缺陷型检出缺陷型l逐个检出法l影印检出法l夹层培养法l限量补给法逐个检出法逐个检出法 影印检出法影印检出法ll夹层培养法 限量补给法限量补给法l在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养,大菌落为野生型小菌落的为缺陷型。l鉴定缺陷型鉴定缺陷型l生长谱法l组合营养物法l组合补充培养基法生长谱法生长谱法 l斜面菌种-生理盐水洗下细胞-洗涤-涂布（105个/皿）纸片纸片1:氨基酸混合液氨基酸混合液;纸片纸片2:维生素混合液维生素混合液;纸片纸片3:核酸水解液核酸水解液;纸片纸片4:酵母水解液酵母水解液组合合营养物法：养物法：A将多种将多种营养因子养因子编组；b.将将组合液的合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；果分析；l一一组：12345二二组：26789三三组：37101112四四组：4811131314五五组：59121415组合合营养物法：养物法：组合补充培养基法组合补充培养基法l如是多个缺陷型菌株，l则制成各营养组合平板，将带测菌株依次点接到这一组平板的对应位置上，l根据在各平板上的生长情况逐个分析各菌株的缺陷型llMM+A+B+C+A+B+A+Cl4、Ames testAmes test：对化学诱变剂做检测对化学诱变剂做检测对化学诱变剂做检测对化学诱变剂做检测原理：his-在基本培在基本培养基上不养基上不长；而；而发生回复突生回复突变则长。菌种：鼠菌种：鼠伤寒沙寒沙门氏菌氏菌his-；第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组原核生物的基因重组原核生物的基因重组l凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组。或遗传重组。l作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交传物质分子水平上的杂交而一般所说的杂交（而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平）则是细胞水平上的一个概念。上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。一形式。一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组特点：l片段性：仅一小段DNAl单向性：共体受体l转移机制多样性：转化、转导、接合、原生质体融合（一）转化（一）转化受体菌直接吸收来自供体菌的游离受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片片段，并把它整合到自己的基因组中，而获段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为为转化。转化后的的受体菌称为转化子转化子（transformant）。）。l来自供体菌的来自供体菌的DNA片段称为片段称为转化因子转化因子1、转化发生的条件、转化发生的条件（1 1）两个菌株间的亲缘关系密切两个菌株间的亲缘关系密切（2）受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.（3 3）供体供体DNADNA片段（片段（转化因子转化因子）大小适宜，分子量一大小适宜，分子量一般为般为1 1 10 106 6 D D 左右，左右，1515个基因个基因 感受态感受态：受体细胞能从环境吸取外源：受体细胞能从环境吸取外源DNADNA片段并实片段并实现其转化的一种生理状态现其转化的一种生理状态（4）单链供体DNA进入受体菌，发生同源重组；（在受体菌表面，一条链被水解）（5）DNA复制，受体细胞分裂，带有新形状的个体为转化子 转染把噬菌体或其它病毒的把噬菌体或其它病毒的DNA（或（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染后代，这种现象称为转染（transfection）。）。l（二）转导（二）转导（Transduction）借助缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导转导。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。转导过程不需要细胞接触，而是以噬菌体为载体转导主要分为：完全普遍性转导l普遍性转导流产普遍性转导低频局限性转导l局限性转导两种类型高频局限性转导（1)普遍性转导（Generalized transduction）由于完全缺陷型噬菌体携带了供体菌染色体片段，当它去感染受体菌时，使后者获得这部分遗传性状的现象称为普遍性转导完全普遍转导条件完全普遍转导条件供体菌-野生型（鼠伤寒沙门氏菌）受体菌-各种营养缺陷型完全缺陷型噬菌体-P22，感染复数1特点：特点：供体的任何基因都有可能进入受体细胞（2）局限性转导）局限性转导Restricted transduction l是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。（2）局限性转导）局限性转导Restricted transduction l条件：供体菌-大肠杆菌K12（）溶源菌（野生型）受体菌-营养缺陷型（Bio-，gal-）部分缺陷温和性噬菌体-d特点：只传递供体菌的少数特定基因正常正常 噬菌体和转导半乳糖（噬菌体和转导半乳糖（gal）的缺陷型噬）的缺陷型噬菌体菌体(dg)的形成过程的形成过程发生误切频率发生误切频率10 4 10 6 因此因此形成转导子的形成转导子的频率低频率低条件：感染复数条件：感染复数m.o.i1受体菌变为形成受体菌变为形成双溶源菌双溶源菌E.coliK12(/dg)UVl转导噬菌体（转导噬菌体（dg）50%+辅助噬菌体（辅助噬菌体（）50%再次侵染其他受再次侵染其他受体细胞体细胞，m.o.I1侵染的侵染的50%受体菌变为转导子受体菌变为转导子（3）、溶源转变）、溶源转变l当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。象，称为溶源转变。l性质：表面上与转导相似，而本质上不同于性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导转导。l（3）、溶源转变）、溶源转变l区别：区别：当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失得的新性状也随之消失温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状噬菌体自身基因使宿主获得新性状温和噬菌体使完整的，不是缺陷的温和噬菌体使完整的，不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子子l白喉棒杆菌：白喉毒素白喉棒杆菌：白喉毒素/温和噬菌体温和噬菌体l肉毒梭菌：肉毒梭菌：C型或型或D型肉毒毒素型肉毒毒素l红霉素链霉菌：合霉素合成和气生菌丝形成红霉素链霉菌：合霉素合成和气生菌丝形成/P4温温和噬菌体和噬菌体（三）接合（三）接合供体与受体供体与受体细胞直接接触，借性菌毛胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体，在受体细胞中胞中发生交生交换、整合，、整合，使之使之获得供体菌的得供体菌的遗传性状的性状的现象，称象，称为接合。接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是通过接合而获得新性状的受体细胞就是接接合子合子conjugantconjugant）l 1946年年J.Lederberg等等采用采用E.coli的两的两株营养缺陷型株营养缺陷型进行实验进行实验大肠杆菌大肠杆菌“接合接合”涉及到的菌株涉及到的菌株F+（雄性）菌株：（雄性）菌株：含游离的F因子14个个，有性菌毛14根根Hfr（高频重组）菌株：（高频重组）菌株：含整合的F因子，有性菌毛，F菌株菌株介于F+菌株与Hfr菌株之间，细胞中有游离的、带小段染色体基因的环状F因子F（雌性）菌株（雌性）菌株：没有F因子，无性菌毛n接合：雌性菌雌性菌X雄性雄性nF+菌株菌株Hfr菌株菌株F菌株菌株n从自然界分离到的从自然界分离到的20002000株株E.E.colicoli中约有中约有30%30%是是F F菌株。菌株。F（雌性）（雌性）菌株接合菌株接合（1）F+FF+F+（2）HfrFHfr+F（在大多数情况下）（在大多数情况下）HfrFHfr+Hfr（或（或F+）（极少数情况下）（极少数情况下）（3）FFF+F注意：注意：接合实验所用到的接合实验所用到的F-菌株是一系列营养缺陷型菌株，菌株是一系列营养缺陷型菌株，当发生重组时，变成原养型当发生重组时，变成原养型l接合的结果转性率高，染色体基因重组率低Hfr菌株菌株中中F因子因子的整合、的整合、断裂和转断裂和转移移Hfr的接合中断实验接合的结果转性低，染色体基因重组率高Hfr的中断杂交实验F因子在Hfr菌株中的染色体上：l插入位点有几个l可以正向，可以反向插入l构成了Hfr1菌株、Hfr2菌株、Hfr3一系列菌株，相对稳定l通过中断实验，划出了环状染色体图lF转导1初生F菌株F转导2次生F菌株（四）原生质体融合（四）原生质体融合l原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。l应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1主要步骤主要步骤l选择亲株、l制备原生质体、l原生质体融合、l原生质体再生l筛选优良性状的融合子。l选择亲株 l选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。l参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。l诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。l应先测定菌株各遗传标记的稳定性，自发回复突变的频率低原生质体制备 l一般都采用酶解法去壁。l根据微生物细胞壁的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。l有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。原生质体融合原生质体融合l聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合l一般PEG的使用浓度范围在25-40%。l原生质体只需要与PEG接触一分钟，l紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。l原生质体再生l就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。l不同微生物的原生质体的最适再生条件不同。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。l细菌一般再生率为3-10%。筛选优良性状融合重组子 l直接法将融合液涂布高渗再生选择培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；l间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，表型延迟后，再涂布高渗再生选择培养基。原生质体融合的优点：原生质体融合的优点：l可以提高重组率可以提高重组率可进行多亲本融合可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量l二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组l有性杂交l准性杂交l原生质体融合l遗传转化（一）有性杂交（一）有性杂交 一般指性一般指性细胞胞间的接合和随之的接合和随之发生的染生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。色体重组，并产生新遗传型后代的过程。凡是能凡是能产生有性生有性孢子的酵母菌或霉菌，子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种似的有性杂交方法进行育种。亲本的单倍化亲本的单倍化有性杂交有性杂交杂交后代的检出杂交后代的检出筛选优良性状个体筛选优良性状个体l工业上应用的酿酒酵母通常是双倍体酵母菌，并且只进入无性世代。l要使这些酵母菌发生基因重组，应先诱使其产生子囊孢子，l再使两个不同性状的亲本发生接合，形成二倍体的杂交后代。ll酒精酵母面包发酵l产酒率高对糖的利用能力强ll子囊孢子子囊孢子ll杂交二倍体lll（二）准性杂交育种（二）准性杂交育种（parasexual hybridization）l准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式，l准性生殖可发生在同一生物的二个不同来源的体细胞之间，经细胞融合但不发生减数分裂，导致低频率的基因重组准性生殖的过程 菌菌丝联结异核体形成（异核体形成（质配）配）核配形成核配形成杂合二倍体合二倍体体体细胞交胞交换和和单倍体化倍体化。l菌丝联结l发生在一些形态上无区别，但遗传特性有差别的两个同种亲本的体细胞之间，发生的频率较低。异核体形成（质配）l同一菌同一菌丝含含有不同有不同遗传性状的性状的细胞细胞核核。l具有野生型性状具有野生型性状（基因互基因互补功能功能），），可在基本培养基上可在基本培养基上生生长；l异核体的分生异核体的分生孢子不能在基本培养基上生子不能在基本培养基