分子植物病理学ppt课件教学教程.ppt
分子植物病理学MolecularPlantPathology绪论绪论1 1、概念（、概念（conception）分子植物病理学是在分子植物病理学是在分子水平分子水平上研究并解释植物病理上研究并解释植物病理现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。2 2、研究内容、研究内容(contents)应用分子生物学理论和应用分子生物学理论和DNA重组技术，研究植物病害重组技术，研究植物病害的发生机制，阐明病程中，寄主病原物的发生机制，阐明病程中，寄主病原物相互作用的分子相互作用的分子基础基础；寄主、病原物与病程相关的；寄主、病原物与病程相关的基因及其结构、表达和基因及其结构、表达和调控机制调控机制。3 3、主要研究方法（、主要研究方法（main strategy）从从“里里”到到“外外”：以研究寄主和病原物的基：以研究寄主和病原物的基因为主要对象，阐明寄主病原物相互作用的有关基因为主要对象，阐明寄主病原物相互作用的有关基因的结构、表达、调控及其产物功能。因的结构、表达、调控及其产物功能。方方 法导向：法导向：先以分子克隆的方法鉴定与致病性先以分子克隆的方法鉴定与致病性有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的影响，确定该基因的类型和作用。影响，确定该基因的类型和作用。在在分子（分子（DNA）水平）水平上通过互补分析和缺失研上通过互补分析和缺失研究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的调节。调节。4 4、分子植物病理学的发展（、分子植物病理学的发展（history）分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物病害的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物病害的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的水平是不平衡的。水平是不平衡的。植物病毒病害的分子生物学研究植物病毒病害的分子生物学研究1935，W.M.Stanley 成功分离出成功分离出TMV结晶，并证明结结晶，并证明结晶的大部分组成是晶的大部分组成是protein.1937,E.C.Borden N.w.Pirie 报道了报道了TMV的化学组成，的化学组成，提出该病毒由提出该病毒由95protein 和和5RNA组成组成19551956，H.Frankel-Conrat 对对TMV的蛋白质和的蛋白质和核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作用提出了令人信服的证据用提出了令人信服的证据可被可被TMV抗体纯化抗体纯化不能被不能被HR抗体纯化抗体纯化侵染植物侵染植物RNA供体病毒的特征供体病毒的特征分离出的病毒颗粒能被分离出的病毒颗粒能被HR抗体钝化抗体钝化杂合病毒杂合病毒TMV CPHR RNA 1958,Gierer et al,用亚硝酸诱变获得用亚硝酸诱变获得TMVTMV突变株突变株,使坏死使坏死病斑从病斑从0.2%0.2%增加到增加到15%,15%,进一步说明病毒进一步说明病毒RNARNA的突变与致病功的突变与致病功能的关系能的关系.植物细菌病害的分子生物学研究植物细菌病害的分子生物学研究植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗传研究在传研究在20世纪世纪70年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了近近40年，较年，较DNA双螺旋的发现晚了将近双螺旋的发现晚了将近20年。年。20世纪世纪5070年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。19531956，D.T.Klein R.M.Klein 发现根癌土壤杆菌的基因转发现根癌土壤杆菌的基因转化与致病性有关的现象。化与致病性有关的现象。1957，R.R.Corey M.P.Starr 发现了菜豆黄单胞的转化作用与其发现了菜豆黄单胞的转化作用与其对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。1966，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。农杆菌（农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）1944,1944,发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的培养基上生长。培养基上生长。19701970，G.Morel et al.发现农杆菌致病菌有两种类型，发现农杆菌致病菌有两种类型，其区别在于对两种不常见其区别在于对两种不常见ArgArg衍生物章鱼碱（衍生物章鱼碱（octopine）和）和胭脂碱（胭脂碱（nopaline）的代谢不同。）的代谢不同。1973,J.A.Lippincoot1973,J.A.Lippincoot证明，无致病力菌株丧失对上证明，无致病力菌株丧失对上述两种述两种ArgArg衍生物的利用能力，因此，农杆菌有衍生物的利用能力，因此，农杆菌有3 3种类型。种类型。typetoxicoctopinenopalineoctopineopalineA +B +C 细菌利用细菌利用 肿瘤组织合成肿瘤组织合成 19741978，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，1977，M.D.Chilton证明农杆菌的证明农杆菌的Ti质粒上只有一小段质粒上只有一小段DNA与肿瘤诱与肿瘤诱发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；1978，J.Schell 首次以首次以Ti为载体把带有抗生素抗性基因的转座子为载体把带有抗生素抗性基因的转座子Tn7转移到植转移到植物细胞中去，开创了以物细胞中去，开创了以Ti质粒为载体转移外源质粒为载体转移外源DNA进入植物的进入植物的植物基因工程研究日益兴旺，同时对植物基因工程研究日益兴旺，同时对Ti质粒的精细分析和与寄质粒的精细分析和与寄主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点.欧氏杆菌欧氏杆菌(Erwinia spp)欧氏杆菌与大肠杆菌相近欧氏杆菌与大肠杆菌相近,同时也是重要植物病原细菌同时也是重要植物病原细菌,因此开始分子遗传学研究较早。因此开始分子遗传学研究较早。2020世纪世纪7070年代年代,M.P.Starr,M.P.Starr实验实验室进行了欧氏杆菌室进行了欧氏杆菌HfrHfr菌株的结合遗传学研究，利用营养缺菌株的结合遗传学研究，利用营养缺陷型标记转移法对其致病基因进行作图陷型标记转移法对其致病基因进行作图,结果表明结果表明,致病基因位致病基因位于染色体上于染色体上hishis和和thrthr两个基因之间两个基因之间.自自1984年年N.T.Keen首次报道从菊欧氏杆菌首次报道从菊欧氏杆菌(E.Chrysanthemi)中克隆到果胶裂解酶基因后中克隆到果胶裂解酶基因后,发表了有关欧氏发表了有关欧氏杆菌中杆菌中2个种个种pel 基因克隆的报道基因克隆的报道,其中涉及编码其中涉及编码5个主要同工酶个主要同工酶的的5个个pel基因基因.假单胞细菌假单胞细菌(Pseudomonas.spp.).)茄青枯假单胞茄青枯假单胞(P.solanacearum)丁香假单胞丁香假单胞(P.syringae)大豆斑点病菌大豆斑点病菌(P.s.pv.glycinea)大豆假单胞大豆假单胞(P.glycinea)植物真菌病害的分子生物学研究植物真菌病害的分子生物学研究 传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害为模式发展起来的为模式发展起来的,但在分子病理学方面的进展明显滞后但在分子病理学方面的进展明显滞后.1979 1979年年M.E.Case在粗糙脉孢霉在粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)和和J.Tilburn在巢曲霉在巢曲霉(Aspergillus)遗传转化系统试验相继取得成遗传转化系统试验相继取得成功后功后,丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速.5 5、分子植物病理学研究进展（、分子植物病理学研究进展（ReviewReview）Gene for Gene Hypothesis 植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗性基因，即寄主分别含有感病基因（性基因，即寄主分别含有感病基因（r）和抗病基因（）和抗病基因（R），），病原分别含有有毒基因（病原分别含有有毒基因（vir）和无毒基因（）和无毒基因（avr），只有），只有当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄主表现感病。主表现感病。5.1 5.1 病原菌致病相关基因的研究进展病原菌致病相关基因的研究进展 致病性基因致病性基因(Pathogenicity genes)是病原均与寄主植是病原均与寄主植物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因毒基因,前者决定对植物表现亲和性前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与即调控病害的发生与发展发展;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。种表现专化性不亲和。无毒基因无毒基因(Avirulent genes)广泛存在于寄主植物的病原广泛存在于寄主植物的病原中，中，Staskawicz et al（1984）通过把含无毒基因）通过把含无毒基因avrA的大的大豆丁香假单胞杆菌豆丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea)6号小号小种的种的Cosmid克隆接合转移到不含克隆接合转移到不含avrA的小种中，以遗传互的小种中，以遗传互补实验，克隆了补实验，克隆了avrA，这是克隆的第一个无毒基因。随后，这是克隆的第一个无毒基因。随后，许多研究者通过类似的方法从不同的病原许多研究者通过类似的方法从不同的病原(包括细菌、真菌包括细菌、真菌和病毒和病毒)中克隆了中克隆了50多个无毒基因，涉及多个无毒基因，涉及4050种病原物。种病原物。5.1.1 5.1.1 植物病毒无毒基因的研究植物病毒无毒基因的研究TMV等近等近10种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。1986,Beachy,et al.将将TMV U1株的外壳蛋白株的外壳蛋白cDNA转转入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒和植物上。和植物上。病毒：病毒：TMV，ALMV，CMV，TRV，PVX，PVY，SMV，BMV，RSV 寄主：寄主：烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻5.1.2 5.1.2 植物病原细菌无毒基因的研究植物病原细菌无毒基因的研究自第一个植物病原细菌无毒基因自第一个植物病原细菌无毒基因avrA从丁香假单胞菌从丁香假单胞菌大豆致病变种大豆致病变种6号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌等植物病原细菌中克隆了等植物病原细菌中克隆了40多个无毒基因，远远超过从其多个无毒基因，远远超过从其它植物病原菌中克隆到的无毒基因。它植物病原菌中克隆到的无毒基因。细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子HR的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是依赖于功能性依赖于功能性hrp(Hypersensitive responses and pathogeni-city)基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到寄主细基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到寄主细胞质内，从而实现其激发子功能。胞质内，从而实现其激发子功能。应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的介导转化植物介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株。因植株。杨希才等杨希才等(2001)(2001)从病原细菌从病原细菌Pseudomonas syringae PV.tomato中获得的无毒基因中获得的无毒基因avrD(0.93kb)和从病原真菌和从病原真菌Phytophthoraparasitica中获得的无毒基因中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别分别与非专一性病原物诱导启动子与非专一性病原物诱导启动子Pill和和BG组成含组成含2 2个嵌合基因个嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表达载体的植物表达载体pYH144和和pYHEt。通过农杆菌通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯介导转化马铃薯,其中用其中用pYH144载体转化载体转化2 2个品种个品种(克新克新1 1号号,2,2号号),),用用pYHEt载体转化载体转化3 3个品种个品种(Desiree,克新克新2 2号号,4,4号号),),通过组织培养分别获得潮霉素通过组织培养分别获得潮霉素(Hygromycin B)标记的转基因马铃薯试管苗标记的转基因马铃薯试管苗,对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。5.1.3 5.1.3 植物病原真菌无毒基因的研究植物病原真菌无毒基因的研究 由于缺乏简便有效的克隆方法由于缺乏简便有效的克隆方法,真菌无毒基因的克隆已真菌无毒基因的克隆已落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆,这已成这已成为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下游信号转导途径的制约因素之一。游信号转导途径的制约因素之一。番茄叶霉病菌番茄叶霉病菌（Cladosporium fulvum）的无毒基因）的无毒基因 现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产生的蛋白。其中之一是无毒基因生的蛋白。其中之一是无毒基因avr9的产物，与番茄抗病基因的产物，与番茄抗病基因cf9的产物特异性互作。的产物特异性互作。目前，已对目前，已对avr9基因产物进行了纯化和测序，明确了其分基因产物进行了纯化和测序，明确了其分子结构，为一个子结构，为一个63个个AA的前体蛋白，的前体蛋白，C末端含有末端含有28个个AA的成熟的成熟激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。所分离的基因克隆表明，所分离的基因克隆表明，avr9的的ORF中有一个中有一个59bp的短内含子。的短内含子。能在能在cf4基因型的番茄上诱导过敏反应的小种专化型激发基因型的番茄上诱导过敏反应的小种专化型激发子及无毒基因子及无毒基因avr4的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克隆到无毒基因隆到无毒基因avr4。稻瘟病菌稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的无毒基因的无毒基因稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。Rice Blast DiseaseZeigler,et al.1994 在已鉴定克隆的在已鉴定克隆的8个个 pwi 基因（基因（pathogenicity of weeping lovegrass,对画眉草致病）。对画眉草致病）。pwi 1基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄主植物品种转化性的概念预测主植物品种转化性的概念预测pwi 2基因有阻止对画眉草侵染的作用。目基因有阻止对画眉草侵染的作用。目前用染色体步查的方法已克隆了前用染色体步查的方法已克隆了pwi 2基因，并进行了测序。研究发现，基因，并进行了测序。研究发现，大多数水稻菌株含有大多数水稻菌株含有1到数个到数个pwi 2拷贝。通过研究具有不同寄主专化性拷贝。通过研究具有不同寄主专化性的稻瘟病菌株的稻瘟病菌株pwi 2同源序列的分布，发现同源序列的分布，发现pwi是一个多基因家族。是一个多基因家族。亚麻栅锈病菌亚麻栅锈病菌（Melampsora lini）无毒基因无毒基因 亚麻锈病的寄主病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出亚麻锈病的寄主病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出3434个抗病基因分别存在于个抗病基因分别存在于7 7个群中。个群中。用用 射线进行缺失诱变克隆到射线进行缺失诱变克隆到4 4个无毒个无毒基因。但目前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。基因。但目前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。大麦云纹病菌大麦云纹病菌（Rhynchosporium secalis）无毒基因无毒基因 大麦近等位基因系大麦近等位基因系Atlas对小种对小种US138.1是感病的，是感病的，Atlas46带有抗病基带有抗病基因因Rrs1是对小种是对小种US138.1抗病的。抗病的。Atlas Atlas46第一代、第二代对小种第一代、第二代对小种US138.1抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种US138.1产生的产生的3种能诱导细胞坏死的多肽种能诱导细胞坏死的多肽NIP1、NIP2和和NIP3在两个品种在两个品种上诱导坏死的能力是相同的。上诱导坏死的能力是相同的。NIP1、NIP2的存在与不亲和互作中坏死的的存在与不亲和互作中坏死的发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种US138.1的不亲和互作的不亲和互作中病程相关蛋白中病程相关蛋白PRHv-1的的mRNA的积累水平比在亲和互作中高，而且只的积累水平比在亲和互作中高，而且只有有US138.1产生的产生的NIP1能特异地诱导带能特异地诱导带Rrs1抗病基因的品种产生抗病基因的品种产生PRHv-1的的mRNA。因此，。因此，NIP1可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正在进行。在进行。5.2 5.2 植物抗病基因的研究植物抗病基因的研究自自Johal,et al(1992)成功克隆出第一个玉米抗圆斑病成功克隆出第一个玉米抗圆斑病R基因基因Hm1以来，迄今人们已经从以来，迄今人们已经从9种不同植物中成功地克种不同植物中成功地克隆出了隆出了22种种R基因。克隆植物基因。克隆植物R基因一般采用产物导向法基因一般采用产物导向法(product-orientated approaches)、鸟枪射击法、鸟枪射击法(shot-gun complementation)、扣除杂交法、扣除杂交法(subtractive hybridization)、转座子标记法转座子标记法(transposon tagging)和图位克隆法和图位克隆法(map-based cloning)等等7种方法，但只有转座子标记法和定位克种方法，但只有转座子标记法和定位克隆法取得了成功。上述隆法取得了成功。上述22种种R基因都是采用这两种方法克基因都是采用这两种方法克隆的。隆的。已已 克克 隆隆 的的 植植 物物 抗抗 病病 基基 因因随着分子生物学技术在分子植物病理学中的广泛应用，随着分子生物学技术在分子植物病理学中的广泛应用，尤其是抗病基因的成功克隆与分析，对植物抗病基因的分子尤其是抗病基因的成功克隆与分析，对植物抗病基因的分子功能已有一定的实验依据。功能已有一定的实验依据。B.Baker和和K.E.Hammond-Kosack等（等（1997）分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病）分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病基因结构特征阐述了植物抗病基因的功能即识别、信号传导基因结构特征阐述了植物抗病基因的功能即识别、信号传导和进化。和进化。有待解决的问题有待解决的问题：在抗病基因产物中那些结构决定病原物的特异性识别？在抗病基因产物中那些结构决定病原物的特异性识别？其下游信号物质是什么？这些物质又是如何起作用的？其下游信号物质是什么？这些物质又是如何起作用的？被诱导的防卫反应对不同病原物为什么具有特异性抗性被诱导的防卫反应对不同病原物为什么具有特异性抗性？自然界中新的抗性基因是如何产生的？自然界中新的抗性基因是如何产生的？第一章第一章 病原物致病相关基因病原物致病相关基因第一节第一节 病原物基因组的结构特征病原物基因组的结构特征 植物病原真菌基因组植物病原真菌基因组 植物病原细菌基因组植物病原细菌基因组 植物病毒基因组植物病毒基因组 植物线虫基因组植物线虫基因组第二节第二节 病原物致病基因的类型病原物致病基因的类型 1 1 决定亲和性的基因决定亲和性的基因 1.1 1.1 1.1 1.1 编码致病因子的基因：编码致病因子的基因：编码致病因子的基因：编码致病因子的基因：胞壁水解酶酶基因、毒素胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因。基因。病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有发现。发现。1.2 1.2 1.2 1.2 克服寄主防卫反应的基因：克服寄主防卫反应的基因：克服寄主防卫反应的基因：克服寄主防卫反应的基因：目前已报道的有植物目前已报道的有植物病原真菌对植保素解毒酶基因（病原真菌对植保素解毒酶基因（pda）。）。2 2 决定不亲和性的基因决定不亲和性的基因2.1 2.1 2.1 2.1 无毒基因（无毒基因（无毒基因（无毒基因（avravr）无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作用，如番茄叶霉病菌的无毒基因用，如番茄叶霉病菌的无毒基因avr9编码编码63个个AA的多肽。而有些的多肽。而有些是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因avrD的产的产物是物是3.4104u的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。TMV的外壳蛋白在含有的外壳蛋白在含有N抗病基因的烟草中是过敏反应的激发抗病基因的烟草中是过敏反应的激发子；其子；其avr表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动蛋白基因也具有无毒基因的功能蛋白基因也具有无毒基因的功能 （Padgett et al，1993）。2.2 2.2 2.2 2.2 决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激发子。韦忠民（发子。韦忠民（1993）证明梨火疫病菌）证明梨火疫病菌hrpN的编码蛋白（的编码蛋白（harpin）具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。第二节第二节 植物病毒的侵染过程植物病毒的侵染过程 与致病相关基因与致病相关基因1 1 侵染过程（自学）侵染过程（自学）王金生王金生.分子植物病理学分子植物病理学.中国农业出版社，中国农业出版社，1999.1999.肖火根肖火根.病毒在植物体内的运转病毒在植物体内的运转.病毒学报病毒学报,2001,17(3):282-287.张振臣张振臣.植物病毒胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究植物病毒胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究 进展进展.农业生物技术学报，农业生物技术学报，2000,8(4):403-408.曹雪松曹雪松.植物病毒在胞内和胞间运动的研究植物病毒在胞内和胞间运动的研究.莱阳农学院学报，莱阳农学院学报，2002,19(4):251-252.2 2 植物病毒致病相关基因植物病毒致病相关基因2.1 2.1 外壳蛋白基因外壳蛋白基因（coat protein gene）R.Beachy(1986)首次将首次将TMV 的的CP基因转入烟草，培育出稳定遗传基因转入烟草，培育出稳定遗传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少15个病毒组中个病毒组中30种病毒的种病毒的CP基因，并成功转化了基因，并成功转化了20多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。CP基因的抗性机理基因的抗性机理：（：（1）抑制病毒脱壳。（）抑制病毒脱壳。（2）干扰病毒的复制。）干扰病毒的复制。（3）限制病毒粒子的扩展与运转。（）限制病毒粒子的扩展与运转。（1）CP基因所表达的基因所表达的mRNA与侵与侵入病毒入病毒RNA之间相互作用之间相互作用（RNA介导的病毒抗性介导的病毒抗性）。）。存在的问题存在的问题（1）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少。（和高抗类型较少。（2）具有潜在危险性。）具有潜在危险性。2.2 2.2 复制酶基因复制酶基因（replicase gene）病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有RNA聚合酶中的聚合酶中的Gly-Asp-Asp三肽基元序列（三肽基元序列（GDD motif）,对维持聚合对维持聚合酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（NTP binding domain），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。Zaitlin et al(1990)将将TMV的的54KD蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。复制酶介导抗性的特点：复制酶介导抗性的特点：（1 1）对完整病毒粒子和裸露病毒对完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。均具有高度抗性。（2 2）抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。（3 3）抗性持续时间长，并对高温（抗性持续时间长，并对高温（3131）不敏感。）不敏感。（4 4）具有明显的株专化性。具有明显的株专化性。抗性机理：抗性机理：（1 1）在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径。途径。（2 2）在在RNARNA水平上，转录出的水平上，转录出的mRNA与病毒的复制酶与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是mRNA诱导了诱导了植物的自然抗性。植物的自然抗性。缺损型复制酶基因也可以介导抗性缺损型复制酶基因也可以介导抗性。T.M.Anderson et al(1992)将将TMV Fny株系的株系的RNARNA内部缺失内部缺失94个核苷酸后个核苷酸后导入烟草，结果，缺失造成导入烟草，结果，缺失造成ORF的移码，其翻译产物只有的移码，其翻译产物只有完整的完整的97KD蛋白的蛋白的75左右，但仍然表达对左右，但仍然表达对CMV的高度的高度抗性。抗性。2.3 2.3 运动蛋白基因运动蛋白基因（movement protein gene）病毒基因编码的基因产物病毒基因编码的基因产物MP能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从而实现病毒在细胞间的运动。从而实现病毒在细胞间的运动。研究证明，完整的研究证明，完整的TMV基因表达并不能介导抗性的产生。基因表达并不能介导抗性的产生。M.Lapidot et al(1993)&SI Malyshenko et al（1993）将）将TMV的缺陷型的缺陷型MP（dMP）基因转入烟草后能获得抗）基因转入烟草后能获得抗TMV植株，进一步研究表明，转植株，进一步研究表明，转dMP基因的烟草不仅对基因的烟草不仅对TMV，还对其他病毒如，还对其他病毒如CMV、BMV等具有不同等具有不同程度的抗性。由此可见，各种病毒程度的抗性。由此可见，各种病毒MP之间虽然缺乏同源性，但具有相之间虽然缺乏同源性，但具有相同的功能。同的功能。抗性机制：由于缺陷型抗性机制：由于缺陷型MP与野生型与野生型MP竞争胞间连丝上的结合位点竞争胞间连丝上的结合位点而实现的。而实现的。2.4 2.4 卫星病毒卫星病毒（satellite RNA）某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段RNA，它们本身并没，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星RNA。携带卫星。携带卫星RNA的病毒称的病毒称为辅助病毒。迄今已报道有为辅助病毒。迄今已报道有6组共组共26种植物病毒带有卫星种植物病毒带有卫星RNA。卫星卫星RNA对植物病毒的影响有对植物病毒的影响有3种表现：种表现：加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；减轻症状。减轻症状。减轻症状。减轻症状。1986年，年，Baulcombe等首次将等首次将CMV的的sat RNA 克隆转入烟克隆转入烟草，获得了抗草，获得了抗CMV的基因工程植株。的基因工程植株。抗性机制：抗性机制：卫星卫星RNA与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星 RNA能更有效地占据能更有效地占据RNA复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，随着复制循环的增加，随着复制循环的增加，sat RNA的复制量远远大于基因组的复制量远远大于基因组RNA复制量，复制量，最终是病毒基因组的复制受阻。最终是病毒基因组的复制受阻。u 虽然卫星虽然卫星RNARNA只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星RNARNA有可能有可能突变成加重症状的卫星突变成加重症状的卫星RNARNA，因此具有一定的潜在危险性。，因此具有一定的潜在危险性。2.5 2.5 核酶基因核酶基因（ribozyme gene）核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它RNA分子的小分子分子的小分子RNA。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星RNA序列中。序列中。根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生物的人们可根据核酶可切割任何生物的RNA，而且对底物作用位点的碱基序，而且对底物作用位点的碱基序列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。人工核酶。目前，人工核酶已成功应用于动物细胞，在体外实现了对目前，人工核酶已成功应用于动物细胞，在体外实现了对HIV等有害基等有害基因转录物的特异性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能因转录物的特异性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒（切割马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTV）等的基因组）等的基因组RNA的核酶、能切割的核酶、能切割苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。内表达不如体外表达有效。该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞RNARNA作为靶作为靶RNARNA切割而切割而破坏细胞正常功能。破坏细胞正常功能。第三节第三节 植物病原细菌的致病相关基因植物病原细菌的致病相关基因1 1 基因克隆的策略和研究方法基因克隆的策略和研究方法1.1 1.1 基因克隆策略基因克隆策略1.2 1.2 突变诱变方法突变诱变方法1.2.1 1.2.1 物理诱变物理诱变1.2.2 1.2.2 化学诱变化学诱变1.2.3 1.2.3 转座子诱变转座子诱变突变方法突变方法1.1.物理诱变物理诱变 紫外线（紫外线（UVUV）、）、X X射线和射线和、射线诱变；射线诱变；离子束诱变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线；中子 2.2.化学诱变化学诱变 化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基胍(NTG）、
