实验三离心技术及酶学实验精品文稿.ppt

实验三离心技术及酶学实验第1页，本讲稿共38页v概念概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、细胞器、生物大分子的沉淀等生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。于各种生物样品的分离和制备。第2页，本讲稿共38页第一节 基本原理v离心力离心力 当一个粒子当一个粒子(生物大分子或细胞器生物大分子或细胞器)在高速在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”F”由下式定义，即：由下式定义，即：第3页，本讲稿共38页v相对离心力（相对离心力（RCF）通常离心力常用地球的引力的倍数来表通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，所以称为相对离心力。示，所以称为相对离心力。在离心场中，作用于颗粒的离心力相当在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。）。第4页，本讲稿共38页v RCF=1.11910-5(rpm)2rv(rpm-revolutions per minute为每分钟转数，r/min)v低速离心时常以转速低速离心时常以转速“rpm”来表示来表示v高速离心时则以高速离心时则以“g”表示表示第5页，本讲稿共38页第二节 离心机的主要构造和类型 工业用离心机工业用离心机离心机离心机 制备性离心机制备性离心机 实验用离心机实验用离心机 分析性离心机分析性离心机 第6页，本讲稿共38页v一、制备性离心机的三类一、制备性离心机的三类1 1 普通离心机：最大转速普通离心机：最大转速6000rpm6000rpm左右左右2 2 高速冷冻离心机：最大转速为高速冷冻离心机：最大转速为2000020000 25000rpm25000rpm（r/minr/min）3 3超速离心机：转速可达超速离心机：转速可达500005000080000rpm80000rpm，超速离心机装有真空系统，这是它与高速离超速离心机装有真空系统，这是它与高速离 心机的主要区别。心机的主要区别。第7页，本讲稿共38页二、转头v1 1角式转头角式转头 第8页，本讲稿共38页v2 2荡平式转头：荡平式转头：这种转头是由吊着的这种转头是由吊着的4 4或或6 6个自由活动个自由活动 的吊桶的吊桶(离心套管离心套管)构成。构成。v3 3区带转头：区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子区带转头无离心管，主要由一个转子 桶和可旋开的顶盖组成。桶和可旋开的顶盖组成。v4 4 垂直转头：垂直转头：其离心管是垂直放置的。其离心管是垂直放置的。v5 5 连续流动转头：连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口 的转头盖及附属装置组成。的转头盖及附属装置组成。第9页，本讲稿共38页三、离心管 v塑料离心管常用材料有聚乙烯塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)(PE)，聚碳酸，聚碳酸酯酯(PC)(PC)，聚丙烯，聚丙烯(PP)(PP)等，其中等，其中PPPP管性能较好。管性能较好。塑料离心管的优点是透明塑料离心管的优点是透明(或半透明或半透明)，硬度，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。第10页，本讲稿共38页v不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。的化学药品，如强酸、强碱等。v离心管盖离心管盖离心前必须盖严，配平时需带管盖重量离心前必须盖严，配平时需带管盖重量防止样品外泄、挥发防止样品外泄、挥发支持离心管，防止离心管变形支持离心管，防止离心管变形第11页，本讲稿共38页v制备性超速离心的分离方法制备性超速离心的分离方法v差速沉降离心法差速沉降离心法 逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。下分批分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的颗粒用途：分离沉降系数相差较大的颗粒优点：操作简便优点：操作简便缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活第12页，本讲稿共38页v密度梯度区带离心法（区带离心法）密度梯度区带离心法（区带离心法）定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。的分离方法。优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤压变形保持活性压变形保持活性缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、操作严格不易掌握操作严格不易掌握第13页，本讲稿共38页五、离心操作的注意事项v使用各种离心机时，使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必管子必须互相对称地放在转头中须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地，以便使负载均匀地分布在转头的周围。分布在转头的周围。v每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。第14页，本讲稿共38页v装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。v若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。v离心过程中不得随意离开第15页，本讲稿共38页实验内容实验内容v酶的提取及比活性测定酶的提取及比活性测定第16页，本讲稿共38页一、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的分离纯化及比活性测定 目的 1掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注意事项 2了解检测AKP活性测定的原理和方法。第17页，本讲稿共38页v方法方法酶的本质：蛋白质酶的本质：蛋白质v盐析法盐析法v有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法v层析法层析法v电泳电泳第18页，本讲稿共38页酶酶组织细胞：先破碎细胞，再用一定的试剂提取体液：直接提取方法物理方法化学方法第19页，本讲稿共38页v原则原则v制备的原料制备的原料v初期采用、后期采用方法初期采用、后期采用方法v影响因素影响因素第20页，本讲稿共38页p影响因素影响因素pH：最适：最适pH温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷氧化：氧化：SH对某些酶的活性必需，加入还原剂对某些酶的活性必需，加入还原剂重金属离子污染：与重金属离子污染：与SH发生作用而失活：发生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，蛋白酶的污染，PMSF、DFP介质的极性和离子强度：疏水介质的极性和离子强度：疏水最稳定pH第21页，本讲稿共38页v评估指标评估指标v酶的纯度用比活性代表酶的纯度用比活性代表v定义：单位重量（定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位）蛋白样品中所含酶的活性单位v表示方法：每表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位蛋白质所具有酶的活性单位v测定方法：测定方法：每每mlml样品中的蛋白质样品中的蛋白质mgmg数数 每每mlml样品中酶的活性单位样品中酶的活性单位酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。第22页，本讲稿共38页p酶的回收率酶的回收率 提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随部分酶的损失。部分酶的损失。在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收率。率。第23页，本讲稿共38页 原理 机械破碎法制备肝匀浆 匀浆液 低浓度醋酸钠：低渗破膜 低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP 有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂，重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33丙酮(30乙醇)：AKP溶解 50丙酮(60乙醇)：AKP不溶解(一)碱性磷酸酶的分离提纯第24页，本讲稿共38页操作步骤 25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆取肝匀浆4ml(A液）A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （2500rpm)5min下清液（吸取）沉淀（弃）+等体积丙酮，离心（2000rpm)5min 上清液（弃）沉淀 +0.5M醋酸镁2ml溶解（B液）第25页，本讲稿共38页操作步骤 B 液 +95%冷乙醇至30%，离心（2500rpm）5min上清液（吸取）沉淀（弃）+95%冷乙醇至60%，离心（2500rpm）5min上清液（弃）沉淀 +0.01M 醋酸镁-醋酸钠2ml,溶解（C液）C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性 C2：取0.1mlC液+0.1ml生理盐水，待测蛋白浓度 B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性B2：取0.1mlB液+0.9ml生理盐水，待测蛋白浓度第26页，本讲稿共38页加入有机溶剂计算公式加入有机溶剂计算公式设加入设加入Xml95%Xml95%乙醇乙醇至终浓度至终浓度30%30%30%30%（B B液体积液体积+X+X）=95%=95%X X X=30%B X=30%B液体积液体积95%-30%=0.462B95%-30%=0.462B液体积液体积至终浓度至终浓度60%60%60%60%（上清液体积（上清液体积+X+X）30%30%上清液体积上清液体积=95%X=95%X X=X=（60%-30%60%-30%）上清液体积）上清液体积 95%-60%=0.867 95%-60%=0.867上清液体积上清液体积第27页，本讲稿共38页 注意事项注意事项 l各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。l操作要在低温下进行操作要在低温下进行l加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。l加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。l离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。第28页，本讲稿共38页(二二)碱性磷酸酶的比活性测定碱性磷酸酶的比活性测定 原理原理 v比活性的定义比活性的定义v单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。v通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。v用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。否的评价指标之一。第29页，本讲稿共38页测定样品的比活性必须测定：测定样品的比活性必须测定：l每毫升样品中的酶活性单位数。每毫升样品中的酶活性单位数。l每毫升样品中的蛋白质毫克数。每毫升样品中的蛋白质毫克数。第30页，本讲稿共38页磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性 AKP 4-AKP 4-氨基安替比林氨基安替比林l磷酸苯二钠磷酸苯二钠 酚酚 醌衍生物（红色）醌衍生物（红色）铁氰化钾铁氰化钾 根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。l3737保温保温1515分钟产生分钟产生1g1g酚者为酚者为1 1个酶活性单位。个酶活性单位。第31页，本讲稿共38页第32页，本讲稿共38页考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 回顾实验原理（实验讲义第60页）。第33页，本讲稿共38页 操作步骤操作步骤 1.AKP1.AKP活性单位测定活性单位测定 取试管取试管5 5支，按下表操作：支，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管ABC0.04mol/L基质液1.01.01.01.01.0pH10碳酸缓冲液0.50.50.50.50.537水浴保温5分钟蒸馏水0.1_酚标准液（0.1mg/ml）_0.1_测定液_A1液0.1B液0.1C1液0.1混匀，立即置于37 水浴保温15分钟第34页，本讲稿共38页 加加0.2M NaOH0.2M NaOH溶液溶液1ml1ml加加0.3%4-0.3%4-氨基安替比林氨基安替比林1ml,0.5%1ml,0.5%铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液2ml2ml，混匀，室温，混匀，室温10min10min，各，各溶液进行溶液进行A510A510测定测定计算：酶活性单位计算：酶活性单位/ml=A/ml=A标本标本/A/A标准标准CC标准（标准（0.10.1）稀释倍数稀释倍数 操作步骤第35页，本讲稿共38页 2.2.蛋白质含量测定蛋白质含量测定 取试管取试管5 5支，按下表操作支，按下表操作试剂（ml）空白管标准管ABC生理盐水0.1标准蛋白溶液0.1样品A2液0.1B2液0.1C2液0.1考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.0 室温室温5min5min，各管进行，各管进行A595A595测定测定计算：样品中蛋白质的含量（计算：样品中蛋白质的含量（l l）=A=A样品样品/A/A标准标准CC标准标准稀释倍数稀释倍数第36页，本讲稿共38页 3.3.结果处理与分析结果处理与分析 结果处理表结果处理表体积(ml)酶活性计算蛋白含量计算比活性(U/mg)酶的得率A值稀释倍数酶活性(U/ml)酶的总活性（U）A值稀释倍数蛋白浓度(mg/ml)A液4100%B液2.2C液2第37页，本讲稿共38页（三）思考题l 酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提 取与纯化成功与否？l测定酶的比活性有何意义？第38页，本讲稿共38页