电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用.ppt

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如何利用各种人工合成的生物体在疾病诊如何利用各种人工合成的生物体在疾病诊断、治疗和药物生产方面做出贡献一直是备受断、治疗和药物生产方面做出贡献一直是备受合成生物学家关注的问题。在工程化设计思想合成生物学家关注的问题。在工程化设计思想的指导下，通过利用标准化、可互换的生物部的指导下，通过利用标准化、可互换的生物部件，合成生物学在疾病机理和药物研究方面已件，合成生物学在疾病机理和药物研究方面已经取得了一些令人瞩目的成绩。经取得了一些令人瞩目的成绩。其具体表现在以下几个方面：其具体表现在以下几个方面：在疾病机理研究方面在疾病机理研究方面在发现新药方面在发现新药方面在疾病治疗与防御方面在疾病治疗与防御方面电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY在疾病机理研究方面在疾病机理研究方面（1）人工重构）人工重构B细胞抗原受体信号处理过程细胞抗原受体信号处理过程（2）人工改造蝙蝠冠状病毒）人工改造蝙蝠冠状病毒在发现新药方面在发现新药方面（1）利用合成基因线路筛选提高抗结核药物的小分子）利用合成基因线路筛选提高抗结核药物的小分子（2）抗感染分子的筛选）抗感染分子的筛选（3）抗癌药物筛选的人工基因网络）抗癌药物筛选的人工基因网络（4）合理设计抗菌肽）合理设计抗菌肽电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY在疾病治疗与防御方面 J.J.Collins的研究小组利用合成生物学的方法对噬的研究小组利用合成生物学的方法对噬菌体进行改造提高其抗菌活性，旨在利用工程化噬菌体菌体进行改造提高其抗菌活性，旨在利用工程化噬菌体杀灭人类的致病细菌。病菌的生物膜能够抵抗抗菌治疗杀灭人类的致病细菌。病菌的生物膜能够抵抗抗菌治疗或者避开宿主免疫系统的攻击，为此摧毁病菌生物膜对或者避开宿主免疫系统的攻击，为此摧毁病菌生物膜对于杀灭致病细菌至关重要。为了溶解生物膜，研究者对于杀灭致病细菌至关重要。为了溶解生物膜，研究者对T7噬菌体进行工程化改造使其能够表达伴放线放线杆噬菌体进行工程化改造使其能够表达伴放线放线杆菌的菌的dispersin B(DspB)。除了生物膜结构，细菌对抗生素的抗药性是另外一除了生物膜结构，细菌对抗生素的抗药性是另外一个对抗细菌感染的主要课题。个对抗细菌感染的主要课题。J.J.Collins课题组率先对课题组率先对大肠杆菌的抗生素抗性对大肠杆菌的抗生素抗性对M13噬菌体进行改造使其产生噬菌体进行改造使其产生LexA3。通过。通过LexA3介导的介导的SOS抑制，使细菌更易被抗抑制，使细菌更易被抗生素攻击而不易产生抗药性。生素攻击而不易产生抗药性。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY5.1.1 环境控制大肠杆菌对癌细胞的侵入系统环境控制大肠杆菌对癌细胞的侵入系统 人体绝大部分正常细胞可以进行有限度的增殖，老人体绝大部分正常细胞可以进行有限度的增殖，老化死亡后会有新生细胞取代它，以维持机体功能。化死亡后会有新生细胞取代它，以维持机体功能。癌也叫恶性肿瘤，癌组织的基本单位是癌也叫恶性肿瘤，癌组织的基本单位是癌细胞癌细胞。癌细胞的特征：癌细胞的特征：无止境的增殖，使患者体内的营养物质被大量消耗。无止境的增殖，使患者体内的营养物质被大量消耗。释放出多种毒素，甚至转移到全身各处生长繁殖。释放出多种毒素，甚至转移到全身各处生长繁殖。破坏正常组织，使人体产生一系列症状，最后导致人破坏正常组织，使人体产生一系列症状，最后导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损直至死亡等损直至死亡等.目前人类对癌症的致病机制还不甚了解，世界卫生组织预测，目前人类对癌症的致病机制还不甚了解，世界卫生组织预测，21世世纪癌症将取代心脑血管疾病成为人类的纪癌症将取代心脑血管疾病成为人类的“第一杀手第一杀手”。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY静脉注射的特点：药液从静脉直接进入血液循环而迅速发生药效静脉注射的特点：药液从静脉直接进入血液循环而迅速发生药效。具有抗癌功能的工程菌具有抗癌功能的工程菌静脉注射静脉注射直接进入血液循环直接进入血液循环探测机制趋向于癌细胞探测机制趋向于癌细胞随血液流经全身随血液流经全身侵入癌细胞侵入癌细胞杀死癌细胞而不损害任何其他正常细胞杀死癌细胞而不损害任何其他正常细胞释放所携带的抗癌成分释放所携带的抗癌成分 如果实现以上过程，则人类完全有可能拥有更强大的对抗如果实现以上过程，则人类完全有可能拥有更强大的对抗癌症这一癌症这一“世纪杀手世纪杀手”的能力。的能力。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 2007年，年，J.C.Anderson等开发出了能够定向并侵入等开发出了能够定向并侵入癌细胞的癌细胞的大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）。大肠杆菌大肠杆菌是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌。除了肠出是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌。除了肠出血性大肠杆菌（血性大肠杆菌（EHEC）等极少数菌种外，大多数大肠杆菌菌株在）等极少数菌种外，大多数大肠杆菌菌株在肠道内并不是致病菌，而且由于其遗传背景研究得比较透彻，大肠肠道内并不是致病菌，而且由于其遗传背景研究得比较透彻，大肠杆菌已经是实验室应用最广泛的工程菌。杆菌已经是实验室应用最广泛的工程菌。J.C.Anderson等的研究从等的研究从大肠杆菌开始，希望在此基础上将研究成果扩展到其他细菌。大肠杆菌开始，希望在此基础上将研究成果扩展到其他细菌。电子课件第五章合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY如果能够实现通过静脉注射大肠杆如果能够实现通过静脉注射大肠杆菌治疗癌症所必须解决的三个难题菌治疗癌症所必须解决的三个难题由静脉注射进入人体血液循环系统的大肠杆菌必须能够选择性由静脉注射进入人体血液循环系统的大肠杆菌必须能够选择性地定位于实体瘤组织；地定位于实体瘤组织；定位于实体瘤组织的大肠杆菌必须能够选择性地侵入癌细胞内定位于实体瘤组织的大肠杆菌必须能够选择性地侵入癌细胞内部而不伤害周围正常的细胞；部而不伤害周围正常的细胞；顺利入侵癌细胞中的大肠杆菌必须能够释放或合成某种能杀死顺利入侵癌细胞中的大肠杆菌必须能够释放或合成某种能杀死癌细胞的物质。癌细胞的物质。J.C.Anderson等主要针对前两步进行研究，开发能够选择性定位等主要针对前两步进行研究，开发能够选择性定位并侵入癌细胞的大肠杆菌，以下介绍他们的工作的主要部分。并侵入癌细胞的大肠杆菌，以下介绍他们的工作的主要部分。电子课件第五章合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY1.大肠杆菌对哺乳动物细胞侵入机制的构建与模块化大肠杆菌对哺乳动物细胞侵入机制的构建与模块化 大肠杆菌具有许多能够与真核细胞发生相互作用的系统，这大肠杆菌具有许多能够与真核细胞发生相互作用的系统，这些天然系统的冗余性和复杂性的控制机制使得人们很难对其进行些天然系统的冗余性和复杂性的控制机制使得人们很难对其进行工程化和利用。工程化和利用。J.C.Anderson等将取自假结核耶尔森氏菌等将取自假结核耶尔森氏菌（Yersinia Pseudotuberculosis）的编码侵袭素的）的编码侵袭素的inv基因基因植入大肠植入大肠杆菌体内，命名含有此基因的大肠杆菌为杆菌体内，命名含有此基因的大肠杆菌为inv+E.coli。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 侵袭素侵袭素是一种长的、不易弯曲的蛋白质，是一种长的、不易弯曲的蛋白质，能够锚定在细胞膜上。将能够锚定在细胞膜上。将inv基因转入大肠杆菌不基因转入大肠杆菌不仅能使大肠杆菌具有侵入细胞的能力，而且能够仅能使大肠杆菌具有侵入细胞的能力，而且能够避开大肠杆菌天然系统各种复杂的干扰，实现侵避开大肠杆菌天然系统各种复杂的干扰，实现侵入机制的模块化。入机制的模块化。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 将将inv基因构筑于中等拷贝数的质粒上，利用基因构筑于中等拷贝数的质粒上，利用Ptet启动子对启动子对其进行控制并命名为其进行控制并命名为pAC-TetInv质粒，如图质粒，如图5-1所示。所示。图图 5-1 pAC-TetInv质粒构建图质粒构建图电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYinv+E.coli能够侵入不同来源的癌细胞，能够侵入不同来源的癌细胞，但由于但由于1 1整联蛋白的表达水平或可接近程度不同，整联蛋白的表达水平或可接近程度不同，inv+E.coli对三种不同的细胞侵袭的效率有所不同。对三种不同的细胞侵袭的效率有所不同。检验其对检验其对HeLa细胞的侵袭能力细胞的侵袭能力检验其对检验其对U2OS(骨肉瘤，骨肉瘤，osteosarcoma)和和HepG2(肝癌，肝癌，hepatocarcinoma)细胞的侵袭能力细胞的侵袭能力将将pAC-TetInv质粒转入大肠杆菌质粒转入大肠杆菌CAMC60菌株中菌株中为了检验含有为了检验含有pAC-TetInv质粒的大肠杆菌质粒的大肠杆菌对哺乳动物细胞的侵入能力，同时检验对哺乳动物细胞的侵入能力，同时检验侵入过程是否需要其他粘附素或菌毛的帮助侵入过程是否需要其他粘附素或菌毛的帮助电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY2.2.侵入机制的诱导控制设计侵入机制的诱导控制设计 抗癌治疗的一个基本要求是尽量降低对正常细胞的侵害。为此，必须抗癌治疗的一个基本要求是尽量降低对正常细胞的侵害。为此，必须对大肠杆菌的侵入功能进行调控，使其只有在需要的时候才开启对大肠杆菌的侵入功能进行调控，使其只有在需要的时候才开启inv基因。基因。研究者将研究者将inv基因置于基因置于ParaBAD启动子的控制下，如图启动子的控制下，如图5-2所示。所示。图图 5-2 pBACr-FdhInv5-2 pBACr-FdhInv质粒构建图质粒构建图电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY为了进一步降低侵袭素的基础表达，研究者还将核糖体结合位点侧翼为了进一步降低侵袭素的基础表达，研究者还将核糖体结合位点侧翼的的5非翻译区（非翻译区（UTR）用随机序列替换，并随机排列第一、第二密码）用随机序列替换，并随机排列第一、第二密码子，由此构建了容量达子，由此构建了容量达106个样本的个样本的RBS库，并采用各种方法对其进库，并采用各种方法对其进行筛选。行筛选。研究者在原本不含有研究者在原本不含有araBAD操纵子的大肠杆菌操纵子的大肠杆菌MC1061菌株中，用菌株中，用araBAD和和araC基因替换基因替换Ptet启动子。启动子。为了降低侵袭素的基础表达，研究者将上述基因构建在单拷贝为了降低侵袭素的基础表达，研究者将上述基因构建在单拷贝BACBAC质质粒（人工细菌染色体）上。粒（人工细菌染色体）上。实验证明了阿拉伯糖分子对于大肠杆菌的侵入能力具有调控实验证明了阿拉伯糖分子对于大肠杆菌的侵入能力具有调控作用。作用。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY3.大肠杆菌对癌细胞的趋向性大肠杆菌对癌细胞的趋向性具有侵入能力的具有侵入能力的inv+E.coli的构建是为了治疗癌症的构建是为了治疗癌症因此必须使大肠杆菌具有定位于肿瘤细胞的趋向性因此必须使大肠杆菌具有定位于肿瘤细胞的趋向性对对于于缺缺氧氧环环境境的的趋趋向向性性依依赖赖于于细细胞胞密密度度的的侵侵入入控控制制电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY(1)对于缺氧环境的趋向性对于缺氧环境的趋向性 由于肿瘤细胞的快速失控生长，导致血液供应不足而产生由于肿瘤细胞的快速失控生长，导致血液供应不足而产生实体瘤内的实体瘤内的缺氧（缺氧（Hypoxia）微环境）微环境。因此，缺氧环境可以作。因此，缺氧环境可以作为识别肿瘤并诱导为识别肿瘤并诱导inv+E.coli侵入的因素。侵入的因素。当生长条件从有氧环境转为缺氧环境时，大肠杆菌中的许当生长条件从有氧环境转为缺氧环境时，大肠杆菌中的许多基因会被强烈诱导表达，其中甲酸脱氢酶（多基因会被强烈诱导表达，其中甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，fdhF）就是最强烈的被诱导基因之一。）就是最强烈的被诱导基因之一。研究者在原有研究的基础上，构建了含有甲酸脱氢酶基因研究者在原有研究的基础上，构建了含有甲酸脱氢酶基因启动子的启动子的pBACr-FdhInv质粒，如图质粒，如图5-2所示，并导入大肠杆菌所示，并导入大肠杆菌细胞，利用此启动子将细胞，利用此启动子将inv+E.coli的侵入与缺氧环境相关联。的侵入与缺氧环境相关联。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY(2)依赖于细胞密度的侵入控制依赖于细胞密度的侵入控制 由于实体瘤所在部分的缺氧微环境、缺乏免疫监视和养分充足等原因，静脉注射以由于实体瘤所在部分的缺氧微环境、缺乏免疫监视和养分充足等原因，静脉注射以后，包括非病原体在内的很多种细菌都会集中于膀胱、脑、乳腺癌等实体瘤处。这为工后，包括非病原体在内的很多种细菌都会集中于膀胱、脑、乳腺癌等实体瘤处。这为工程菌对肿瘤的定位提供了另一个线索程菌对肿瘤的定位提供了另一个线索。研究者构筑了研究者构筑了pAC-LuxInv质粒，质粒，在在luxI下游放置下游放置inv和和Prlux启动子的融启动子的融合基因如图合基因如图5-3所示。含有此质粒的大所示。含有此质粒的大肠杆菌，只有当其在肿瘤微环境中的肠杆菌，只有当其在肿瘤微环境中的菌体聚集密度达到并超过某一阈值时菌体聚集密度达到并超过某一阈值时才会迅速开启才会迅速开启inv基因而侵入癌细胞。基因而侵入癌细胞。同样的，研究者也对同样的，研究者也对RBS进行了筛选进行了筛选和优化。和优化。图图5-3 pAC-LuxInv质粒构件图质粒构件图电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYY.pseudotuberculosis的的inv基因基因V.fisheri的的lux操纵系统操纵系统fdhF启动子启动子阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖操纵子融合融合使大肠杆菌细使大肠杆菌细胞能够选择性胞能够选择性地在高细胞密地在高细胞密度、低氧微环度、低氧微环境和化学诱导境和化学诱导后具有侵入多后具有侵入多种癌细胞的能种癌细胞的能力。力。如果在此基础上使大肠杆菌具有释放或者催化合成某种如果在此基础上使大肠杆菌具有释放或者催化合成某种能够杀死癌细胞的物质，那么癌症的彻底治愈将指日可待。能够杀死癌细胞的物质，那么癌症的彻底治愈将指日可待。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY S.Topp等利用人工合成的等利用人工合成的Riboswitch使大肠杆菌具有发现使大肠杆菌具有发现并跟踪化学信号的能力。其构建的系统机理如图并跟踪化学信号的能力。其构建的系统机理如图5-4所示。所示。图图5-4 对茶碱敏感的合成对茶碱敏感的合成Riboswitch控制控制CheZ蛋白翻译示意图蛋白翻译示意图电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 在大肠杆菌中，磷酸酶在大肠杆菌中，磷酸酶CheZ能够触发能够触发CheY的脱磷酸的脱磷酸化，使大肠杆菌移动和翻滚。为控制趋向作用，研究者将化，使大肠杆菌移动和翻滚。为控制趋向作用，研究者将cheZ基因与对茶碱敏感的适配体融合。基因与对茶碱敏感的适配体融合。mRNA的构象中核糖体结合位点碱基配对出现，其后的部分无法的构象中核糖体结合位点碱基配对出现，其后的部分无法翻译成翻译成CheZ蛋白，蛋白，CheY-P蛋白仍然保持磷酸化状态，细胞不移蛋白仍然保持磷酸化状态，细胞不移动。动。细胞中无茶碱存在细胞中无茶碱存在细胞中有茶碱存在细胞中有茶碱存在mRNA的构象中核糖体结合位点暴露在外，其后的序列顺利翻译的构象中核糖体结合位点暴露在外，其后的序列顺利翻译出出CheZ蛋白，触发蛋白，触发CheY脱磷酸化，使大肠杆菌移动和翻滚，具脱磷酸化，使大肠杆菌移动和翻滚，具有对茶碱梯度分布的趋向性。有对茶碱梯度分布的趋向性。这一研究成果同样具有广泛的应用价值，为实现工程菌跟踪病理这一研究成果同样具有广泛的应用价值，为实现工程菌跟踪病理信使侵入并杀死恶性肿瘤细胞奠定了基础。信使侵入并杀死恶性肿瘤细胞奠定了基础。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY5.1.2 合成青蒿素的微生物工厂合成青蒿素的微生物工厂 疟疾俗称打摆子，是由疟原虫经按蚊叮咬传播的传染病。疟疾俗称打摆子，是由疟原虫经按蚊叮咬传播的传染病。它是发生最频繁的人类寄生虫病，对于全球卫生事业的冲击它是发生最频繁的人类寄生虫病，对于全球卫生事业的冲击仅次于结核病，每年在全球约有仅次于结核病，每年在全球约有5亿亿宗病例，导致超过宗病例，导致超过100万万人死亡。世界卫生组织曾指出，疟疾平均每人死亡。世界卫生组织曾指出，疟疾平均每30s杀死一个杀死一个5岁以岁以下的儿童。下的儿童。疟原虫能快速产生抗药性，一些高效抗疟药物氯喹疟原虫能快速产生抗药性，一些高效抗疟药物氯喹（chloroquine）、奎宁（）、奎宁（quinine，又称为金鸡纳霜）和甲氟，又称为金鸡纳霜）和甲氟喹（喹（mefloquine）等都已经基本失效，在某些地方，甚至发现）等都已经基本失效，在某些地方，甚至发现有的疟原虫对目前所有价格低廉的一线药物都有交叉抗药性，有的疟原虫对目前所有价格低廉的一线药物都有交叉抗药性，为此全世界范围内掀起了研制新型抗疟疾药物的科研热潮。为此全世界范围内掀起了研制新型抗疟疾药物的科研热潮。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 青蒿素青蒿素属于萜类化合物，是大约属于萜类化合物，是大约5万种类异戊二烯类万种类异戊二烯类化学物中的一种。它具有高效、快速、低毒以及与氯喹化学物中的一种。它具有高效、快速、低毒以及与氯喹无交叉影响的特点，并被世界卫生组织认定为无交叉影响的特点，并被世界卫生组织认定为21世纪替世纪替代奎宁的最有效抗疟疾药。代奎宁的最有效抗疟疾药。但是青蒿草中的青蒿素的含量极其低（普遍低于但是青蒿草中的青蒿素的含量极其低（普遍低于1%），导致植物提取青蒿素的成本很高。而类异戊二烯），导致植物提取青蒿素的成本很高。而类异戊二烯类物质的结构十分复杂，化学合成的产量极其有限，很类物质的结构十分复杂，化学合成的产量极其有限，很难实现工业化。难实现工业化。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY20世纪世纪70年代，首次从青蒿草中提取得到青蒿素（年代，首次从青蒿草中提取得到青蒿素（artemisinin）2003年美国加州大学伯克利分校化学工程系教授年美国加州大学伯克利分校化学工程系教授J.D.Keasling研究小组利用合成生物学的方法构建工程大肠杆菌，使其可以研究小组利用合成生物学的方法构建工程大肠杆菌，使其可以合成青蒿素的前体物质合成青蒿素的前体物质amorphadiene。(Nature Biotechnology)2006年年J.D.Keasling研究小组利用合成生物学的方法构建研究小组利用合成生物学的方法构建工程酵母，使其可以合成一种更直接的青蒿素前体衍生物工程酵母，使其可以合成一种更直接的青蒿素前体衍生物青蒿酸（青蒿酸（artemisinic acid）。（）。（Nature）电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY J.D.Keasling研究小组在大肠杆菌中设计了一条合成研究小组在大肠杆菌中设计了一条合成amorphadiene的生物合成途径。整条生物合成途径如图的生物合成途径。整条生物合成途径如图5-5所示。所示。amorphadiene乙乙酰酰辅辅酶酶AatoBHMGStHMGR甲甲羟羟戊戊酸酸idiERG12ERG8MVD1ispAIPPDMAPPFPPtHMGRMVD1ERG12ERG8PyrunateG3PDXPMEPADSispC图图5-5 人工构建大肠杆菌人工构建大肠杆菌amorphadiene合成途径合成途径电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY其工作主要分为以下四部分：其工作主要分为以下四部分：采用各种方法优化大肠杆菌中原有的合成采用各种方法优化大肠杆菌中原有的合成IPP和和DMAPP的脱氧的脱氧-5-磷酸木酮糖磷酸木酮糖（deoxyxylulose 5-phosphate，DXP）途径，效果很不明显；）途径，效果很不明显；J.D.Keasling等等引入了引入了ispC基因，利用其产物将大肠杆菌原有的基因，利用其产物将大肠杆菌原有的DXP途径切断，斩断所有未知途径切断，斩断所有未知因素经由因素经由DXP途径对生物途径对生物IPP和和DMAPP的影响，净化大肠杆菌的代谢内途径的影响，净化大肠杆菌的代谢内途径。净化大肠杆菌的代谢内途径净化大肠杆菌的代谢内途径合成和优化编码合成和优化编码amorphadiene合成酶的基因合成酶的基因ADS在原核生物中表达植物基因是非常困难的，在原核生物中表达植物基因是非常困难的，为了使植物基因为了使植物基因ADS（紫穗槐二烯（紫穗槐二烯合成酶基因）在大肠杆菌中高效表达，合成酶基因）在大肠杆菌中高效表达，J.D.Keasling等人工合成和优化了等人工合成和优化了ADS基因，大幅提高了基因，大幅提高了amorphadiene的产量。的产量。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY将酿酒酵母中的甲羟戊酸途径转入大肠杆菌将酿酒酵母中的甲羟戊酸途径转入大肠杆菌为了提高细胞内为了提高细胞内FPP的浓度，将酿酒酵母中编码甲羟戊酸途径的的浓度，将酿酒酵母中编码甲羟戊酸途径的8个基因做出两个个基因做出两个操纵子，并将其转入大肠杆菌中表达。操纵子，并将其转入大肠杆菌中表达。平衡和优化合成途径平衡和优化合成途径为了避免发生在人工构建的合成为了避免发生在人工构建的合成amorphadiene多步反应的许多中间产物（包括多步反应的许多中间产物（包括IPP）在高浓度时导致菌体死亡，）在高浓度时导致菌体死亡，J.D.Keasling等不仅对每个基因进行徒步筛选，等不仅对每个基因进行徒步筛选，同时还对不同基因的突变型进行整合，以挑选出最优搭配。同时还对不同基因的突变型进行整合，以挑选出最优搭配。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 2006年，在此项成果的基础上，研究人员又将宿年，在此项成果的基础上，研究人员又将宿主细胞换成酿酒酵母。利用工业酿酒酵母中工程化的主细胞换成酿酒酵母。利用工业酿酒酵母中工程化的甲羟戊酸途径、取自青蒿（甲羟戊酸途径、取自青蒿（Artemisia annua）的）的amorphadiene合成酶和细胞色素合成酶和细胞色素P450单加氧酶单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）共同作用来生产高浓度、更直接的青蒿素前体衍生物共同作用来生产高浓度、更直接的青蒿素前体衍生物青蒿酸（青蒿酸（artemisinic acid）。）。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY乙乙酰酰辅辅酶酶AERG10 ERG13tHMGR甲甲羟羟戊戊酸酸ERG12 ERG8ERG19 idiIPPDMAPPDPPERG20FPPADSamorphadieneCYP71AV1/CPR青蒿酸青蒿酸利用工业酵母生产青蒿素分为三个步骤，其示利用工业酵母生产青蒿素分为三个步骤，其示意图如下：意图如下：图图5-6 人工构建酿酒酵母的青蒿酸合成途径人工构建酿酒酵母的青蒿酸合成途径电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 在这三步中，每一步的优化都可以提高最终的青蒿在这三步中，每一步的优化都可以提高最终的青蒿酸产量，而酸产量，而FPP代谢途径的优化则效果更为显著，因此研代谢途径的优化则效果更为显著，因此研究者主要从以下几个方面着手。究者主要从以下几个方面着手。（1 1）过量表达）过量表达tHMGR。（2 2）通过甲硫氨酸可抑制启动子（）通过甲硫氨酸可抑制启动子（PMET3）下调）下调ERG9编码角鲨烯编码角鲨烯合成酶，阻断合成酶，阻断FPPFPP向下合成固醇的支路，进一步避免向下合成固醇的支路，进一步避免FPP的不必要的不必要消耗。消耗。（3 3）过表达）过表达upc2-1并结合并结合ERG9的下调。的下调。（4 4）将所有被修饰基因都整合到染色体上，确保宿主菌中基因表）将所有被修饰基因都整合到染色体上，确保宿主菌中基因表达的稳定性。达的稳定性。（5 5）降低细胞密度，确保养分充足并避免不必要的互相干扰。）降低细胞密度，确保养分充足并避免不必要的互相干扰。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 青蒿酸的提取和纯化也是一个至关重要的青蒿酸的提取和纯化也是一个至关重要的步骤。研究者开发了一种新的纯化方法，即用步骤。研究者开发了一种新的纯化方法，即用醚将青蒿酸从洗脱液中提取出来，再利用硅酸醚将青蒿酸从洗脱液中提取出来，再利用硅酸凝胶进行柱状层析分离，得到的青蒿酸纯度可凝胶进行柱状层析分离，得到的青蒿酸纯度可大于大于95%。在。在1L生物反应器中，能够生产生物反应器中，能够生产115mg青蒿酸，利用该方法可以提取出其中的青蒿酸，利用该方法可以提取出其中的76mg。电子课件第五章 合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYSemi-synthesis of the antimalarial artemisininNATURE BIOTECHNOLOGY,2003Concentrations of amorphadiene,the sesquiterpene olefin precursor to artemisinin,reached 24 g caryophyllene equivalent/ml电子课件第五章合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYSemi-synthesis of the antimalarial artemisininNATURE,2006Here we report the engineering of Saccharomycescerevisiae to produce high titres(up to 100 mg/L)of artemisinic acid using an engineered mevalonate pathway,amorphadiene synthase,and a novel cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)from A.annua(黄花蒿黄花蒿)that performs a three-step oxidation of amorpha-4,11-diene to artemisinic acid.电子课件第五章合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYSemi-synthesis of the antimalarial artemisininPNAS,2011电子课件第五章合成生物学-健康卫生应用 北京理工大学北京理工大学BEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYBEIJING INSTITUTE OF TECHNOLOGYSemi-synthesis of the antimalarial artemisininPNAS,2011amorpha-4,11-diene,41 gL;artemisinic acid,2.3 gLDevelopment of fed-batch glucose/ethanol and ethanol feed fermentations.(A)Growth and(B)amorpha-4,11-diene production by Y337 with restricted glucose feed and mixed glucose and ethanol feed,and Y293 with ethanol pulse feed(replicate fermentations)and restricted ethanol fe