实验四离子交换层析分离单核苷酸精品文稿.ppt
实验四离子交换层析分离单核苷酸第1页，本讲稿共17页 目的要求目的要求 通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，学学学学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。第2页，本讲稿共17页 离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（Ion Exchange ChromatographyIon Exchange ChromatographyIon Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography简称为简称为简称为简称为IECIECIECIEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同结合力不同结合力不同结合力不同进进进进行分离纯化的层析方式行分离纯化的层析方式行分离纯化的层析方式行分离纯化的层析方式。离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理第3页，本讲稿共17页树脂树脂树脂树脂 N+(CH N+(CH N+(CH N+(CH3 3 3 3)OH-OH-OH-OH-离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换剂由离子交换剂由基质基质、电荷基团电荷基团（或称功能基团）或称功能基团）和和 反离子反离子组成组成。基质一般是不溶性聚合物，如基质一般是不溶性聚合物，如树脂，树脂，树脂，树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖纤维素，葡聚糖，醇脂糖纤维素，葡聚糖，醇脂糖纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；等；等；等；纤维素纤维素纤维素纤维素O O O O CH CH CH CH2 2 2 2 COO COO COO COO-Na Na Na Na 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子 第4页，本讲稿共17页n nRA+BRA+BRA+BRA+B RBRBRBRBA A A A+(RA(RA(RA(RA是阳离子交换剂，是阳离子交换剂，是阳离子交换剂，是阳离子交换剂，B B B B为为为为溶液中的离子或待分离的生物分子）溶液中的离子或待分离的生物分子）溶液中的离子或待分离的生物分子）溶液中的离子或待分离的生物分子）离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 当当当当A+=B+,RBRA,A+=B+,RBRA,A+=B+,RBRA,A+=B+,RBRA,说明说明说明说明 R R R R 与与与与B B B B的结的结的结的结 合力比合力比合力比合力比A A A A大；反之亦然。大；反之亦然。大；反之亦然。大；反之亦然。对于两性蛋白而言，结合力取决于其对于两性蛋白而言，结合力取决于其对于两性蛋白而言，结合力取决于其对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及等电点以及等电点以及等电点以及 溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH值值值值。第5页，本讲稿共17页平衡装柱平衡装柱平衡装柱平衡装柱 离子交换剂带上反离子离子交换剂带上反离子离子交换剂带上反离子离子交换剂带上反离子(R-O-X(R-O-X(R-O-X(R-O-X+)上样上样上样上样 样品（样品（样品（样品（A A A A,B+B+B+B+，C C C C+，等）与反离子（，等）与反离子（，等）与反离子（，等）与反离子（X X X X）竞争与电荷基团结）竞争与电荷基团结）竞争与电荷基团结）竞争与电荷基团结合；（结合力合；（结合力合；（结合力合；（结合力A A A A B+B+B+B+Y Y Y Y+C C C C+X X X X）洗脱洗脱洗脱洗脱 洗脱液中的离子成分（洗脱液中的离子成分（洗脱液中的离子成分（洗脱液中的离子成分（Y Y Y Y）与样品）与样品）与样品）与样品(A(A(A(A等）竞争结合电荷基等）竞争结合电荷基等）竞争结合电荷基等）竞争结合电荷基团，首先团，首先团，首先团，首先C C C C洗下来，随着洗下来，随着洗下来，随着洗下来，随着Y Y Y Y浓度增加，浓度增加，浓度增加，浓度增加，B B B B洗脱出，最后洗脱出，最后洗脱出，最后洗脱出，最后A A A A出来，使样品分离。出来，使样品分离。出来，使样品分离。出来，使样品分离。所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤第6页，本讲稿共17页离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤第7页，本讲稿共17页n n1.1.1.1.单核苷酸的结构单核苷酸的结构单核苷酸的结构单核苷酸的结构 碱水解使核酸降解为碱水解使核酸降解为碱水解使核酸降解为碱水解使核酸降解为2 2 2 2 或或或或3 3 3 3 单核苷酸混合物，在单核苷酸混合物，在单核苷酸混合物，在单核苷酸混合物，在2 2 2 2，或，或，或，或3 3 3 3 位位位位带磷酸基团。带磷酸基团。带磷酸基团。带磷酸基团。离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理第8页，本讲稿共17页2.2.2.2.阴离子交换层析分离单核苷酸的依据阴离子交换层析分离单核苷酸的依据阴离子交换层析分离单核苷酸的依据阴离子交换层析分离单核苷酸的依据 单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点 AMP 2.65 AMP 2.65 AMP 2.65 AMP 2.65 GMP 2.35 GMP 2.35 GMP 2.35 GMP 2.35 CMP 4.5 CMP 4.5 CMP 4.5 CMP 4.5 UMP 1.55 UMP 1.55 UMP 1.55 UMP 1.55按等电点由高到低：按等电点由高到低：按等电点由高到低：按等电点由高到低：CMPAMPGMPUMPCMPAMPGMPUMPCMPAMPGMPUMPCMPAMPGMPUMP 但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是 ：CMP-AMP-UMP-GMPCMP-AMP-UMP-GMP 如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：CMPAMPGMPUMPMPAMPGMPUMP离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理第9页，本讲稿共17页3.23.23.23.2，3 3 3 3 单核苷酸等电点的差异单核苷酸等电点的差异单核苷酸等电点的差异单核苷酸等电点的差异 由于由于由于由于2 2 2 2 和和和和3 3 3 3 核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环上碱基基团的上碱基基团的上碱基基团的上碱基基团的pKpKpKpK值有区别，所以值有区别，所以值有区别，所以值有区别，所以2 2 2 2 和和和和3 3 3 3 核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸的PIPIPIPI值有区别。值有区别。值有区别。值有区别。2 2 2 2 核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸的PIPIPIPI值略高于值略高于值略高于值略高于3 3 3 3 核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱时出现时出现时出现时出现2 2 2 2个峰。个峰。个峰。个峰。离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理第10页，本讲稿共17页n4.4.离子交换剂的类型离子交换剂的类型离子交换剂的类型离子交换剂的类型 所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季铵基。铵基。铵基。铵基。树脂树脂树脂树脂 N N N N+(CH(CH(CH(CH3 3 3 3)3 3 3 3离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理第11页，本讲稿共17页离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤n n1 1 1 1）样品的获得）样品的获得）样品的获得）样品的获得 以以以以KOH 37CKOH 37CKOH 37CKOH 37C水解酵母水解酵母水解酵母水解酵母RNARNARNARNA，生成，生成，生成，生成2 2 2 2 或或或或3 3 3 3 核苷酸混合物。最核苷酸混合物。最核苷酸混合物。最核苷酸混合物。最终终终终pHpHpHpH值调到值调到值调到值调到8.08.08.08.0（注意核苷酸所带电荷！注意核苷酸所带电荷！注意核苷酸所带电荷！注意核苷酸所带电荷！）。具体操作见讲义）。具体操作见讲义）。具体操作见讲义）。具体操作见讲义p23p23。n n2)2)2)2)交换剂的平衡和装柱交换剂的平衡和装柱交换剂的平衡和装柱交换剂的平衡和装柱 以以以以甲酸钠甲酸钠甲酸钠甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（溶液平衡，反离子为甲基（溶液平衡，反离子为甲基（溶液平衡，反离子为甲基（COO-COO-COO-COO-）。具体步骤见讲义）。具体步骤见讲义）。具体步骤见讲义）。具体步骤见讲义p23p23p23p23。3 3 3 3）加样）加样）加样）加样 以滴管加入以滴管加入以滴管加入以滴管加入1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml样品，以样品，以样品，以样品，以3 3 3 34d/min4d/min4d/min4d/min 的速度让其进入层析柱。然的速度让其进入层析柱。然的速度让其进入层析柱。然的速度让其进入层析柱。然后以后以后以后以200ml ddH200ml ddH200ml ddH200ml ddH2 2 2 2O O O O洗柱至洗柱至洗柱至洗柱至ODODODOD2602602602600.020.020.020.02。第12页，本讲稿共17页离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤4 4 4 4）洗脱并检测）洗脱并检测）洗脱并检测）洗脱并检测 依次用以下溶液分段洗脱：依次用以下溶液分段洗脱：依次用以下溶液分段洗脱：依次用以下溶液分段洗脱：250ml250ml250ml250ml 0.02mol/L0.02mol/L0.02mol/L0.02mol/L甲酸；甲酸；甲酸；甲酸；250ml250ml250ml250ml 0.15mol/L0.15mol/L0.15mol/L0.15mol/L甲酸；甲酸；甲酸；甲酸；250ml 250ml 250ml 250ml 0.01mol/L0.01mol/L0.01mol/L0.01mol/L甲酸甲酸甲酸甲酸0.05mol/L0.05mol/L0.05mol/L0.05mol/L甲酸钠溶液（甲酸钠溶液（甲酸钠溶液（甲酸钠溶液（pH4.44pH4.44pH4.44pH4.44);250ml);250ml);250ml);250ml 0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L甲酸甲酸甲酸甲酸0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L甲甲甲甲酸钠溶液（酸钠溶液（酸钠溶液（酸钠溶液（pH3.74);pH3.74);pH3.74);pH3.74);流速流速流速流速1ml/min1ml/min1ml/min1ml/min。收集洗脱液，收集洗脱液，收集洗脱液，收集洗脱液，10ml10ml10ml10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。第13页，本讲稿共17页离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤5)5)5)5)分析检测分析检测分析检测分析检测 a.a.a.a.根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱曲线曲线曲线曲线(如图所示）。如图所示）。如图所示）。如图所示）。第14页，本讲稿共17页离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤b.b.b.b.保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在230230230230300nm300nm300nm300nm波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。第15页，本讲稿共17页思考题思考题 通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交换层析作用的的效果？换层析作用的的效果？换层析作用的的效果？换层析作用的的效果？第16页，本讲稿共17页The End！第17页，本讲稿共17页
