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生物化学试验基础生物化学试验基础第1页，本讲稿共42页1教学目的教学目的n n掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能验技能；n n掌握分光光度计的使用、离心技术、电泳、层掌握分光光度计的使用、离心技术、电泳、层析等的原理和操作技能；析等的原理和操作技能；n n掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；纯化和测定技术的原理及方法；n n培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。作风、创新能力等综合素质。第一节第一节 生生 物物 化化 学学 实实 验验 绪绪 论论第2页，本讲稿共42页2 通过生物化学实验主要做到n n学习设计或验证一个试学习设计或验证一个试(实实)验的基本思路，掌验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。的实验，合理地安排实验步骤和时间。n n训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。物化学实验仪器。n n学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够科学、规范、提高实验报告的写作能力，能够科学、规范、清洁、整齐地进行所有的实验。清洁、整齐地进行所有的实验。n n掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技能，掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技能，为今后参加科研及技术工作打下坚实的基础。为今后参加科研及技术工作打下坚实的基础。第3页，本讲稿共42页3 实验记录实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。量的数据。实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.0500.050”，而不能记成，而不能记成“0.050.05”。每个结果都。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂家等；生物材料的来源、试剂号、编号、生产厂家等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。的规格、试剂的浓度等。第4页，本讲稿共42页 1)生物化学生物化学实验实验不同于化学和生物学不同于化学和生物学实验实验，而有其独特的，而有其独特的实验实验技能和基本操作。技能和基本操作。课课前必前必须认须认真真预预习习，明确，明确实验实验目的、原理、操作关目的、原理、操作关键键步步骤骤及注意事及注意事项项。2)要十分注意要十分注意实验实验安全，未安全，未经实验经实验指指导导老老师师允允许许不得开、关任何不得开、关任何电电源和源和仪仪器器设备设备开关（按开关（按钮钮）。）。3)实验时应实验时应本着本着认认真、真、积积极的极的态态度，在教度，在教师师的指的指导导下完成每次下完成每次实验实验。注意。注意观观察察实验过实验过程中出程中出现现的的现现象和象和结结果，并果，并对实验结对实验结果展开果展开讨论讨论。结结果不良果不良时时，必，必须须重做。重做。4)实验实验中，听从老中，听从老师师指指导导，严严格遵守操作格遵守操作规规程，取用程，取用试剂时试剂时，应应仔仔细细辨明辨明标签标签，以免，以免取取错错。取完。取完试剂试剂后，后，应应及及时时将瓶盖盖好，放回原将瓶盖盖好，放回原处处，切忌乱拿乱放，切忌乱拿乱放，“张张冠李戴冠李戴”。并。并应应及及时时将将实验结实验结果和原始数据如果和原始数据如实记录实记录在在实验报实验报告上，按告上，按时时写出写出实验报实验报告。告。5)实验实验后，必后，必须须把把仪仪器洗器洗净净放入放入仪仪器柜内；清器柜内；清扫实验扫实验台面、地面；台面、地面；试剂试剂瓶要瓶要摆摆放整放整齐齐。要。要经经常保持常保持实验实验室内清室内清洁洁，不乱，不乱丢纸丢纸屑及所有固体屑及所有固体废废弃物。弃物。6)自自觉觉遵守遵守课课堂堂纪纪律，不律，不迟迟到早退；保持室内安静；不高声到早退；保持室内安静；不高声谈谈笑。同学笑。同学间应间应互助友互助友爱爱。4 实验室规则实验室规则第5页，本讲稿共42页7)爱护实验爱护实验器材，非本次器材，非本次实验实验使用的使用的仪仪器器设备设备未未经经老老师师允允许许不得乱不得乱动动。本次。本次实验实验必必须须使用的使用的仪仪器器设备设备，在了解，在了解仪仪器性能和操作器性能和操作规规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将部件或将部件带带出室外。出室外。实验过实验过程中，如程中，如发现设备损发现设备损坏或运坏或运转转异常，异常，应应立即立即报报告老告老师师。8)实验实验室内室内严严禁禁饮饮、食及吸烟、食及吸烟!对对腐腐蚀蚀性或易燃性性或易燃性试剂试剂，操作，操作时时要格外小心。如酒精、要格外小心。如酒精、乙乙醚醚等低沸点有机溶等低沸点有机溶剂剂，使用，使用时应时应禁明火，禁明火，远远离火源，若需加离火源，若需加热热要用水浴加要用水浴加热热，不可直，不可直接在火上加接在火上加热热。用吸量管吸取。用吸量管吸取试剂时应试剂时应使用吸球，使用吸球，严严禁用嘴吸取。禁用嘴吸取。对对于有毒、腐于有毒、腐蚀蚀的的试试剂剂更更应应注意，注意，应应避免其直接接触人体及衣物。乙避免其直接接触人体及衣物。乙醚醚、丙、丙酮酮等易燃等易燃试剂应远试剂应远离火源，以免离火源，以免发发生意外生意外。9)注意注意实验实验室室卫卫生、整生、整洁洁。废废弃液体弃液体应应倒入水槽，放水冲走，有毒倒入水槽，放水冲走，有毒废废弃物弃物应应放入放入废废物缸物缸并及并及时时作无害化作无害化处处理理,实验实验用用过过的棉花、的棉花、废纸废纸、沉淀、沉淀废废渣及其他渣及其他废废弃物品等均弃物品等均应应放入指放入指定容器，不得随意乱扔或定容器，不得随意乱扔或丢进丢进水槽。水槽。10)每次每次实验课实验课由学生由学生轮轮流流值值日。日。值值日生要日生要负责负责打打扫实验扫实验室的室的卫卫生，整理生，整理实验实验室。室。检查检查水、水、电电，关好，关好门门窗，窗，经经老老师检查师检查后，方可离开后，方可离开实验实验室。室。4 实验室规则实验室规则第6页，本讲稿共42页5 实验须知实验须知n n实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确实验目标，能简述实验内容及主要的操作确实验目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。步骤。n n实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，实验实验数据，提倡实事求是的科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。做错应要求重做，反对弄虚作假。n n实验结束后，要认真书写实验报告，及时交实验结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。老师批阅。第7页，本讲稿共42页6 实验报告实验报告实验报告包括如下内容：实验报告包括如下内容：实验报告包括如下内容：实验报告包括如下内容：n n实验项目实验项目实验项目实验项目(实验题目实验题目实验题目实验题目）;n n实验目的实验目的实验目的实验目的;n n实验原理实验原理实验原理实验原理;n n实验器材实验器材实验器材实验器材;n n主要操作步骤主要操作步骤主要操作步骤主要操作步骤;n n实验结果实验结果实验结果实验结果;n n问题分析与讨论等。问题分析与讨论等。问题分析与讨论等。问题分析与讨论等。第8页，本讲稿共42页第二节 紫外-可见分光光度计的使用原理和方法 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计分析条件的选择分析条件的选择测定方法测定方法第9页，本讲稿共42页目视比色法回顾n n比较溶液颜色深浅，从而确定被测定组分含量的方法，称为目视比色法。n n目视比色法的准确度和精密度受视力条件影响很大，一般相对误差约在520的范围。第10页，本讲稿共42页常用的目视比色法 最常用的目视比色法是标准系列法最常用的目视比色法是标准系列法:取一套比色管，于各管中分别加入一系列不取一套比色管，于各管中分别加入一系列不同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色定容。同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色定容。此时一系列标准溶液的管中显出由浅到深的色阶。此时一系列标准溶液的管中显出由浅到深的色阶。被测溶液在同一条件下显色被测溶液在同一条件下显色:将被测溶液管与标准系列进行比较将被测溶液管与标准系列进行比较，若与其若与其中某一管颜色相同可认为被测溶液浓度与此管浓中某一管颜色相同可认为被测溶液浓度与此管浓度相等，若被测溶液颜色介于两标准颜色之间，度相等，若被测溶液颜色介于两标准颜色之间，可认为被测溶液浓度等于两管浓度的平均值。可认为被测溶液浓度等于两管浓度的平均值。第11页，本讲稿共42页常用的目视比色法标准系列标准系列未知样品未知样品特点特点利用自然光利用自然光比较吸收光的互补色光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）准确度低（半定量）不可分辨多组分不可分辨多组分方法简便，灵敏度高方法简便，灵敏度高第12页，本讲稿共42页1)紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(UV-VIS)按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析定性分析、定量分析定量分析及结构分析结构分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱第13页，本讲稿共42页紫外光：紫外光：远紫外光（远紫外光（10-200 nm10-200 nm）和）和近紫外光近紫外光（200-400 nm200-400 nm）的电磁辐射。的电磁辐射。可见光：可见光：400-800 nm400-800 nm的电磁辐射。溶液中物质选择性的电磁辐射。溶液中物质选择性的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就会呈现出一定的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就会呈现出一定的颜色。的颜色。比色分析法比色分析法：比较有色物质溶液颜色深浅来确：比较有色物质溶液颜色深浅来确定物质含量的方法。定物质含量的方法。分光光度法分光光度法：使用分光光度计进行吸收光谱分析的：使用分光光度计进行吸收光谱分析的方法。方法。第14页，本讲稿共42页2)紫外-可见分光光度法的特点：(1)与其它光谱分析方法相比，其仪器设备仪器设备 和和操作都比较简单，费用少，分析速度快操作都比较简单，费用少，分析速度快;(2)灵敏度高灵敏度高;(3)选择性好选择性好;(4)精密度和准确度较高精密度和准确度较高;(5)用途广泛用途广泛。第15页，本讲稿共42页3)紫外-可见吸收光谱 物质对光的选择性吸收 物质对光光的吸收是选择性选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础光谱法的基础。第16页，本讲稿共42页通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸吸收曲线收曲线。在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长max进行物质含量的测定。第17页，本讲稿共42页 吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以A作图 吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh 第18页，本讲稿共42页图示第19页，本讲稿共42页n n吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：（1 1）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大处对应的波长称为最大吸收波长maxmax 。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（2 2）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似maxmax不不变。变。在在maxmax处，吸光度处，吸光度A A正比于浓度正比于浓度C C 测定最灵敏测定最灵敏（3 3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。定性分析的依据之一。第20页，本讲稿共42页4)影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性等）不同，吸收光谱的溶剂极性等）不同，吸收光谱的形状形状形状形状、吸收峰吸收峰吸收峰吸收峰的位置、的位置、吸收吸收吸收吸收强度强度强度强度等可能发生变化。等可能发生变化。温度温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。第21页，本讲稿共42页溶剂溶剂注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。第22页，本讲稿共42页5)紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量定量分析分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定。第23页，本讲稿共42页2.2 朗伯-比尔定律设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则I0=Ia+Itl吸光度和透光度吸光度和透光度第24页，本讲稿共42页溶液的吸光定律溶液的吸光定律透光率透光率 （透射比）（透射比）Transmittance透光率定义：透光率定义：T 取值为取值为0.0%100.0%全部吸收全部吸收T=0.0%全部透射全部透射T=100.0%入射光入射光 I0透射光透射光 It第25页，本讲稿共42页吸光度吸光度:为透光度倒数的对数，用A表示A=lg1/T=-lgT=lgI0 0/It t透光度：透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即T=It/I0第26页，本讲稿共42页 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A=kc l 式中比例常数k(吸光系数)与吸光物质的本性、入射光波长(单色光纯度)及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。第27页，本讲稿共42页偏离朗伯-比耳定律的因素（1）入射光为非单色光）入射光为非单色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可使吸光质点的吸光特性变化大。第28页，本讲稿共42页2.3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计基本结构:光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统样品样品第29页，本讲稿共42页 组组组组 成成成成 部件部件部件部件第30页，本讲稿共42页第31页，本讲稿共42页0.575光源光源单色器单色器检测器检测器显显示示主要部件第32页，本讲稿共42页光源：光源：用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有有热辐射光源热辐射光源和和气体放电光源气体放电光源两类。两类。热辐射光源热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯,钨灯和碘钨灯可使用的钨灯和碘钨灯可使用的范围在范围在350 2500 nm；气体放电光源气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。用于紫外光区，如氢灯和氘灯。它们可在它们可在180 400 nm范围内产生连续光源。范围内产生连续光源。在紫外光区只能用石英比色皿在紫外光区只能用石英比色皿。紫外。紫外可见分光光度计通常都配有可见分光光度计通常都配有可见和紫外两种光源。可见和紫外两种光源。第33页，本讲稿共42页光源：光源：提供符合要求的入射光。提供符合要求的入射光。要求：要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。紫外光源-氘灯(180-400 nm)(气体放电光源)可见光源-钨灯(350-2500nm)(热辐射光源)光光光光 源源源源第34页，本讲稿共42页氘灯氘灯氢灯氢灯钨灯钨灯第35页，本讲稿共42页单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。2单色器单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。单色器的作用从波长范围较宽的入射单色器的作用从波长范围较宽的入射光线中，过滤分出波段较窄的单色光光线中，过滤分出波段较窄的单色光第36页，本讲稿共42页吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。3吸收池吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）第37页，本讲稿共42页4检测器检测器的作用是检测光信号，将光信号转变为电信号并予以放大。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。5信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。第38页，本讲稿共42页比色法的定量方法：标准曲线法:将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度（一）单组分的定量方法（一）单组分的定量方法A=Kc l第39页，本讲稿共42页续前续前续前续前标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法第40页，本讲稿共42页AXCXA（吸光度）（吸光度）C（浓度）（浓度）第41页，本讲稿共42页实验室常用的水实验室常用的水:自来水自来水 去离子水去离子水不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰离子，离子，PH值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的。但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的。蒸馏水蒸馏水是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，一般的有机是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，一般的有机杂质可以去除，但是无机离子还是存在。杂质可以去除，但是无机离子还是存在。还原糖与DNS 反应产生棕红色物质,加入足够量的酒石酸酒石酸钾钠是为了消除溶解氧的影响,添加苯酚苯酚可增加试剂的显色作用,添加亚硫酸硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性.第42页，本讲稿共42页