生物显微技术 第二章 切片的制作精品文稿.ppt

生物显微技术 第二章 切片的制作第1页，本讲稿共28页石蜡切片的过程石蜡切片的过程v动物的处死动物的处死v动物组织取材动物组织取材v固定固定v组织固定后的处理组织固定后的处理v脱水和透明脱水和透明v包埋包埋v切片切片第2页，本讲稿共28页一、动物的处死一、动物的处死v麻醉麻醉v空气栓塞空气栓塞v颈椎脱臼或断头颈椎脱臼或断头v股动脉放血股动脉放血第3页，本讲稿共28页二、动物组织取材二、动物组织取材v动物组织取材原则：动物组织取材原则：尽量保持组织的生活状态。尽量保持组织的生活状态。v动作要快动作要快v不要过度用力夹捏组织，不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。防止组织变形。第4页，本讲稿共28页三、固定三、固定v1、目的：、目的：尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。化、自溶。保持细胞和组织原有的形态结构，保持细胞和组织原有的形态结构，保持组织内部成分特征不发生变化。保持组织内部成分特征不发生变化。v2、方式：浸入式、方式：浸入式 灌注式灌注式第5页，本讲稿共28页灌注式灌注式v此法适用于动物实验研究。自左心室插入主此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。投入固定液。v灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。达到充分固定之目的。第6页，本讲稿共28页3、固定液、固定液v醛类固定剂醛类固定剂v非醛类固定剂非醛类固定剂v丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂第7页，本讲稿共28页醛类固定剂醛类固定剂v双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。v包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛v通常与其他的试剂联合使用通常与其他的试剂联合使用v优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。v缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生且产生“福尔马林色素福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。转化的酸形成正铁血红素。第8页，本讲稿共28页非醛类固定剂非醛类固定剂v氯化汞（氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂）：蛋白的强固定剂v重铬酸钾：重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。v苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，v醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。v蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。v四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与 电镜观察切片的固定与染色。电镜观察切片的固定与染色。第9页，本讲稿共28页丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂v丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。低温下保持酶活性效果好。v乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。良。第10页，本讲稿共28页混合固定剂混合固定剂v固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。对组织所致的缺陷。第11页，本讲稿共28页v4%多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4v成分：成分：4%多聚甲醛溶于多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，倍的磷酸缓冲液中，v1倍的磷酸缓冲液倍的磷酸缓冲液:PBS MVv NaCl 140mM 58.44 v KCl 2.7mM 74.55v NaH2PO412H2O，10mM 358.14v KH2PO4 1.8mM 136.09v 调调pH至至7.4。第12页，本讲稿共28页Bouins液液v苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原固定糖原v37%-40%福尔马林液福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪固定蛋白和脂肪v冰醋酸冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质凝固核染色质第13页，本讲稿共28页固定组织时应注意：固定组织时应注意：v应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。v组织块不易过大过厚，必须小于组织块不易过大过厚，必须小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。以内。v固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。以上，否则组织中心固定不良影响效果。第14页，本讲稿共28页固定时间的选择v不同的研究目的所需使用的固定液。v材料的大小，组织的特性与致密度。v温度的不同有所差别。第15页，本讲稿共28页组织固定后的处理组织固定后的处理v冲洗或漂洗：冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。的人为假象。v修块修块:大小合适、去除形态不好的部分，大小合适、去除形态不好的部分，第16页，本讲稿共28页四、脱水四、脱水v脱水目的：脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。运用某种溶剂置换组织内的水分。v脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等第17页，本讲稿共28页v乙醇乙醇：最常用的脱水剂：最常用的脱水剂v一般组织：一般组织：70%-80%-90%-100%-100%v特殊组织：特殊组织：30%-40-%-50%-60%-70%-80%-90%-100%-100%每步每步30分钟左右。分钟左右。v要求：要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间v 不能过度脱水（使组织变脆）不能过度脱水（使组织变脆）v不同组织脱水时间不同：不同组织脱水时间不同：v大的致密的组织需要延长脱水时间大的致密的组织需要延长脱水时间v为加速各级酒精的穿透力，脱水可为加速各级酒精的穿透力，脱水可在在37温箱中进行。温箱中进行。第18页，本讲稿共28页五、透明或媒浸五、透明或媒浸目的与作用目的与作用v对组织的最后脱水处理对组织的最后脱水处理v与包埋剂置换与包埋剂置换透明剂：透明剂：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂剂v100%乙醇脱水后进入二甲苯两乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。次，保证透明完全。第19页，本讲稿共28页六、包埋六、包埋包埋剂的特点：包埋剂的特点：v具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。v能完全进入组织。能完全进入组织。v对组织内部成分损伤小。对组织内部成分损伤小。第20页，本讲稿共28页石蜡包埋石蜡包埋v石蜡特点：熔点：石蜡特点：熔点：45-50 软蜡软蜡v 55-60 55-60 硬蜡硬蜡 常用常用v石蜡的处理：石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去处杂质。并用滤纸过滤去处杂质。加加5%10%的蜂蜡的蜂蜡,增加石蜡的韧性。增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。反复溶的旧蜡包埋效果更好。v程序：在溶蜡箱中进行程序：在溶蜡箱中进行55-6055-60，恒温。，恒温。v浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1 1：1 1）中两次，）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。在石蜡中两次，每次一个小时左右。v包块：在室温进行包块：在室温进行第21页，本讲稿共28页第22页，本讲稿共28页第23页，本讲稿共28页七 石蜡切片v载玻片处理：v切片：v展片：背面与玻片。v烘片：37的温箱内烤干(约需12小时)。第24页，本讲稿共28页v优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。v缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。第25页，本讲稿共28页火棉胶切片法火棉胶切片法v透明剂：乙醚与乙醇等量混合透明剂：乙醚与乙醇等量混合v包埋剂：火棉胶溶于透明剂包埋剂：火棉胶溶于透明剂v包埋：常温进行包埋：常温进行v凝固：在乙醚中过夜，凝固：在乙醚中过夜，v 在氯仿中过夜。在氯仿中过夜。v在在70%乙醇中保存。乙醇中保存。第26页，本讲稿共28页v优点：优点：可切大的组织可切大的组织v 可切较硬的组织如硬骨可切较硬的组织如硬骨v缺点：操作所用时间长缺点：操作所用时间长v 一般切片厚度为一般切片厚度为20-30m。v 不能连续切片不能连续切片v 全部试剂为易燃物质，注意防火全部试剂为易燃物质，注意防火第27页，本讲稿共28页冰冻切片法 v取材：液氮保存v载玻片处理v切片v保存：-70 或-20 第28页，本讲稿共28页