素材：单克隆抗体制备的三次筛选--高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

单克隆抗体制备的三次筛选科学家们是如何做到运用特定的培养基将肉眼无法观察的细胞筛选出来的呢？在动物细胞工程的教学中，设计到非常重要的应用单克隆抗体的制备过程，这个过程技术很成熟了，但这个技术背后的原理教材上只是做了非常简单的描述，这个过程真的有点复杂，主要是化学物质的名称有点拗口，很多同学甚至老师都不明白。DNA合成的两条途径：核酸的合成有两条途径：一条是全合成途径，即从一些小分子物质先合成为嘌呤、嘧啶，最后合成代谢必需的核酸，氨基蝶呤（aminopterin，A）能够阻止DNA全合成途径。另一条是应急途径，可直接利用外源核苷酸合成 DNA。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸苷激酶（TK）是应急途径中的两种重要酶。HGPRT的作用是将次黄嘌呤、鸟嘌呤转变成次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸参与 DNA 合成。TK 的作用是将胸腺嘧啶核苷转化为脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸（dTMP），再进一步合成 DNA。HAT培养基筛选杂交瘤细胞是将融合的细胞放入 HAT选择培养基中，该培养基有三种关键成分：次黄嘌呤（hy-poxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。氨基蝶呤可阻断骨髓瘤细胞利用全合成途径合成 DNA，使骨髓瘤细胞致死。在这样的培养基上，细胞就只剩下一条应激途径可以合成DNA了。B细胞和骨髓瘤细胞都只剩下这一条路径了，B细胞无法增殖死亡，骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的细胞怎么区分呢？第一次筛选诱导应激路径有缺陷的骨髓瘤细胞通过突变诱导次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞，并经过毒性培养基筛选出的 HGPRT-或 TK-骨髓瘤细胞。具体方法是将诱导突变的骨髓瘤细胞放入含氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的鸟嘌呤类似物培养基上，含HGPRT-的骨髓瘤细胞会将氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤转变成相应的核苷酸形式参与 DNA 合成而发生毒性作用，使细胞致死。而 HGPRT-骨髓瘤细胞由于HGPRT活性丧失，不能使用氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤，能生活在高浓度的含氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的鸟嘌呤类似物培养基上。同理，在培养基中加入5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR），其中的5-溴尿嘧啶是嘧啶类似物，可筛选出 TK-骨髓瘤细胞。所以在进行单克隆抗体制备时，选取的骨髓瘤细胞是已经应激路径有缺陷的细胞，只有全合成路径正常哦！这才是真正的第一次筛选。第二次筛选经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的淋巴 B细胞和骨髓瘤细胞、融合的淋巴 B细胞和淋巴 B 细胞、融合的骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞、未融合的淋巴 B 细胞、未融合的骨髓瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的淋巴 B 细胞在培养基中存活仅5 d-7 d，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的骨髓瘤细胞则需要进行特别的筛选加以去除。由于氨基蝶呤可阻断骨髓瘤细胞利用全合成途径合成 DNA，使骨髓瘤细胞致死。因而，只有融合细胞具有亲代双方的遗传特性，利用淋巴 B细胞中存在的应急途径合成 DNA，才能在 HAT 培养基中生存。经HAT选择培养基培养1d-2d，将有大量的骨髓瘤细胞死去，3 d-4 d后骨髓瘤细胞消失，再培养7d-10 d后改用HT培养液培养2周，然后改用一般培养液培养，即可获得所需的杂交骨髓瘤细胞。第三次筛选第三次筛选的目的是获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相应的一种效应 B 淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经 HAT培养液筛选出的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原决定簇的特异性杂交瘤细胞，才能制备单一性抗体。筛选的方法很多：（1）抗原与抗体发生的免疫学反应，通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释后接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个杂交瘤细胞，再由这些单细胞克隆生长，当细胞形成集落时，进行专一性抗体阳性检测。（2）免疫荧光技术，是一种将免疫反应的特异性与荧光分子的可见性结合起来的方法。在一定条件下，用化学方法将荧光物质（荧光素）与抗体结合，但不影响抗体与抗原的结合活性，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下观察。（3）放射免疫测定，是一种以放射性同位素作为标记物，将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合起来的测定技术。应用竞争性结合的原理，用放射性同位素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性来判断，可进行超微量分析，敏感性高，用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。（4）酶联免疫吸附测定，是一种以抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后会显色，以颜色变化判断试验结果的测定技术。将可溶性抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，再进行免疫酶反应，用分光光度计比色以定性或定量，这是目前应用最广泛的生物学技术之一。学科网（北京）股份有限公司