海洋微生物多样性及其研究方法学习教案.pptx

会计学1海洋海洋(hiyng)微生物多样性及其研究方法微生物多样性及其研究方法第一页，共73页。浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖地球表面积的70.8%。从海面到海底深层蕴藏(yncng)着数量惊人的生物、能源、矿产以及空间资源。目前的研究表明，海洋微生物不仅在海洋生态环境和物质循环中具有极其重要的作用，也是各种新型生物活性物质的潜在来源。由于世界面临严重的资源、环境、人口问题，海洋生物资源包括海洋微生物资源的开发与多样性研究已成为各沿海国家关注的热点。第1页/共72页第二页，共73页。1914年，Issatchenko出版(chbn)第一本海洋微生物研究专著北冰洋细菌的研究，确定了海洋微生物学的研究方向，并使海洋微生物学发展成为独立的学科。第2页/共72页第三页，共73页。Certes,A.第3页/共72页第四页，共73页。vvZoBell,C.E.1946.Marine Microbiology.Chronica Botanica,Waltham,MA.ZoBell,C.E.1946.Marine Microbiology.Chronica Botanica,Waltham,MA.vvJohnson,T.W.et al.1961.Fungi in Oceans and Estuaries(Johnson,T.W.et al.1961.Fungi in Oceans and Estuaries(海湾海湾(h(h iwn)iwn)）.Weinheim published by J.CramerWeinheim published by J.CramervvMarine Microbial Ecology.Chapman&Hall pressMarine Microbial Ecology.Chapman&Hall pressvvMicrobiology of Oceans and Estuaries.Elsevier Publishing,LondonMicrobiology of Oceans and Estuaries.Elsevier Publishing,LondonvvColwell,R.R.,et al.1974.Effect of the Ocean Environment on Microbial Colwell,R.R.,et al.1974.Effect of the Ocean Environment on Microbial Activities.University Park Press,Baltimore.Activities.University Park Press,Baltimore.vvColwell,R.R.,et al.1975.Marine and Estuarine Microbiology Laboratory Colwell,R.R.,et al.1975.Marine and Estuarine Microbiology Laboratory Manual.University Park Press,BaltimoreManual.University Park Press,BaltimorevvThe living ocean:Marine microbiology.Croom HelmThe living ocean:Marine microbiology.Croom HelmvvLitchfield,C.D.1976.Marine Microbiology.Dowden,utchingon&Ross Inc.Litchfield,C.D.1976.Marine Microbiology.Dowden,utchingon&Ross Inc.第4页/共72页第五页，共73页。vvSieburth,J.McN.1979.Sieburth,J.McN.1979.Sea MicrobesSea Microbes.Oxford University Press.Oxford University PressvvVincent,W.F.1988.Vincent,W.F.1988.Microbial Ecosystems of AntarcticaMicrobial Ecosystems of Antarctica.Cambridge.Cambridge University press,New YorkUniversity press,New YorkvvAustin,B.1988.Austin,B.1988.Marine MicrobiologyMarine Microbiology.Cambridge University Press.Cambridge University PressvvBartlett,D.H.2000.Bartlett,D.H.2000.Molecular Marine MicrobiologyMolecular Marine Microbiology.Horizon.Horizon Scientific pressScientific pressvvKirchman,D.L.2000.Kirchman,D.L.2000.Microbial Ecology of the Oceans.Microbial Ecology of the Oceans.Wiley_Liss Wiley_Liss presspressvvPaul,J.H.2001.Paul,J.H.2001.Marine MicrobiologyMarine Microbiology(Methods in Microbiolgy,volume (Methods in Microbiolgy,volume 30)Academic Press30)Academic PressvvSmith J.2002.Smith J.2002.Microbiology of Marine&Freshwater Environments.Microbiology of Marine&Freshwater Environments.Chapman&HallChapman&HallvvMunn,C.B.2004.Munn,C.B.2004.Marine Microbiology:Ecology and ApplicationMarine Microbiology:Ecology and Application.BIOS.BIOS Scientific PublishersScientific Publishers第5页/共72页第六页，共73页。vvHobbie,J.E.1984.Heterotrophic Activity in the Sea(NATO conference Hobbie,J.E.1984.Heterotrophic Activity in the Sea(NATO conference series)Plenum Pub Corpseries)Plenum Pub CorpvvVreeland,R.H.1991.Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal VentsVreeland,R.H.1991.Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents（热水（热水(r shu(r shu)口）口）(Microbiology of Extreme and Unusual (Microbiology of Extreme and Unusual Environments).CRC PressEnvironments).CRC PressvvKarl,D.M.1995 The Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents Karl,D.M.1995 The Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents(Crc Series on Microbiology of Extreme and Unusual Environments).(Crc Series on Microbiology of Extreme and Unusual Environments).Crc Pr I LlcCrc Pr I Llcvv 。第6页/共72页第七页，共73页。vv薛廷耀编薛廷耀编.海洋细菌学海洋细菌学.科学出版社科学出版社.1962 .1962 北京北京vv克里斯克里斯 A E.A E.著著.孙国玉，李世珍译孙国玉，李世珍译.海洋微生物学海洋微生物学（深海）（深海）.科学出版社科学出版社.1964 .1964 北京北京 vv林永成，林永成，周世宁主编周世宁主编.海洋微生物及其代谢产物海洋微生物及其代谢产物(chnw).(chnw).化学工业出版社化学工业出版社.2003.2003 北京北京第7页/共72页第八页，共73页。海洋海洋(hiyng)细菌的多样性细菌的多样性第8页/共72页第九页，共73页。摘自Martinko J M.,et al.1997,Brock Biology of Microorganisms（中译本）生物生物(shngw)系统发育系统发育第9页/共72页第十页，共73页。摘自Martinko J M.,et al.1997,Brock Biology of Microorganisms（中译本）细菌细菌(xjn)系统发育系统发育第10页/共72页第十一页，共73页。微生物种类微生物种类(zhngli)多样性多样性第11页/共72页第十二页，共73页。What is marine bacteria?第12页/共72页第十三页，共73页。关于物种关于物种(wzhng)的概念的概念物种是一个可以相互交配繁殖的自然群体，并与其他群体在生殖上是隔离的（Mayr,1969）；物种是一个具有自身进化趋向和历史结局的祖裔群体的单一谱系(px)，并维持其特性与其他类似谱系(px)不同（Wiley,1978）；微生物的种是一群具有高度表型相似的菌株的集合体，该菌株集合与其他类群的菌株存在明显差异（Stanier,1986）；第13页/共72页第十四页，共73页。species,units of evolution and ecology,should be considered as ecologically unique(e.g.different biotypes,virulence（至病）至病）properties,habitats,host ranges)-from:Ward D.M.,A natural species concept for-from:Ward D.M.,A natural species concept for prokaryotes.Curr Opin Microbiol 1998,1:271-277prokaryotes.Curr Opin Microbiol 1998,1:271-277第14页/共72页第十五页，共73页。Major horizontal zonation in an ocean profile.(Soruce:Odum1971.)Intertidal:潮间带neritic浅海(qin hi)区 euphotic zone 透光层 Aphotic zone无光层 Continental shelf大陆架 Continental slope大陆斜坡 Continental rise大陆隆 hadal zone深海带(6000米以下)abyssal plain深海平原trench沟 第15页/共72页第十六页，共73页。Principal environmental characteristics of an estuary.HWOST=high water line of spring tide;LWOST=low water line of spring tide.第16页/共72页第十七页，共73页。Thermal Vent Communities第17页/共72页第十八页，共73页。vv Marine bacteria should exhibit growth at salinities Marine bacteria should exhibit growth at salinities between 20-40 parts per thousand.between 20-40 parts per thousand.vv True marine bacteria will not grow in the absence of True marine bacteria will not grow in the absence of sodium chloride.sodium chloride.vv Marine bacteria must be capable of growth at the low Marine bacteria must be capable of growth at the low nutrient concentrations found in the oceans.nutrient concentrations found in the oceans.vv Marine bacteria must be capable of growth at low temperatures.第18页/共72页第十九页，共73页。海洋(hiyng)细菌种类多样性及其分布第19页/共72页第二十页，共73页。古菌（ARCHAEA）嗜泉古菌界（Crenarchaeota）广域古菌界（Euryarchaeota）初生(ch shn)古菌界（Korarchaeota）第20页/共72页第二十一页，共73页。真细菌（EUBACTERIA）变形细菌（Proteobacteria）-、-subclass蓝细菌（Cyanobacteria）革兰氏阳性细菌（Gram-positive bacteria）噬 纤 维(xinwi)菌 属-黄 杆 菌 属（Cytophaga-Flavobacterium）浮霉状菌（Planctomycetales）疣微菌（Verrucomicrobiales）螺旋体（Spirochaeta）绿色非硫细菌（Green non-sulfur bacteria）第21页/共72页第二十二页，共73页。海洋环境中发现的部分Proteobacteria类群(li qn)的细菌第22页/共72页第二十三页，共73页。海洋环境中发现的部分(b fen)革兰氏阳性细菌第23页/共72页第二十四页，共73页。海洋细菌基因(jyn)资源多样性第24页/共72页第二十五页，共73页。目前已克隆的来自海洋细菌(xjn)的基因第25页/共72页第二十六页，共73页。海洋细菌的特性海洋细菌的特性及其对多样性研究及其对多样性研究(ynji)的的影响影响第26页/共72页第二十七页，共73页。海洋细菌的培养特性1 附着性和集结性2 生长(shngzhng)缓慢3 特殊的培养要求4 存在活的不可培养状态（viable-but-nonculturable）第27页/共72页第二十八页，共73页。海洋细菌的形态和生理生化特性1 海洋微生物细胞(xbo)形态的多变性2 生理生化反应的多变性3 不易传代和保存4 难以分类鉴定第28页/共72页第二十九页，共73页。各种生态环境中可培养的微生物占该生境各种生态环境中可培养的微生物占该生境微生物总数微生物总数(zngsh)的比例的比例第29页/共72页第三十页，共73页。要判断海洋环境中分离的微生物是海洋生物十分困难。尽管大部分在大海发现的细菌与非海洋细菌有区别(qbi)，但长期以来，却没有一个确定的标准用于区别(qbi)海洋的与非海洋的细菌，也没有对海洋细菌做出明确定义。第30页/共72页第三十一页，共73页。海洋细菌海洋细菌(xjn)多样性多样性研究方法及其进展研究方法及其进展第31页/共72页第三十二页，共73页。Beijerinck,M.W.(1889):vv How may one recover samples of water or sediment from the How may one recover samples of water or sediment from the desired location and know that the samples are uncontaminated desired location and know that the samples are uncontaminated by the overlying water?by the overlying water?vv How does one culture these mysterious creatures?How does one culture these mysterious creatures?vv What are their requirements for growth?vv Will they even grow in the laboratory at all?Will they even grow in the laboratory at all?vv What kinds of microorganisms are there?What kinds of microorganisms are there?vv Do they fit into the classical taxonomic schemes?第32页/共72页第三十三页，共73页。取样的方法1 海水样品(yngpn)的采集 微生物采水器、错流过滤设备2 海洋沉积物的采集 底栖生物采泥器、shinkai6500、Kaiko第33页/共72页第三十四页，共73页。vv 依赖微生物分离(fnl)培养的研究方法vv 不依赖微生物分离(fnl)培养的研究方法海洋细菌多样性研究(ynji)方法第34页/共72页第三十五页，共73页。依赖微生物培养的研究方法依赖微生物培养的研究方法1 1 海洋细菌的分离培养海洋细菌的分离培养2 2 海洋细菌的分类海洋细菌的分类(fn li)(fn li)鉴定鉴定第35页/共72页第三十六页，共73页。特定特定(tdng)海洋细菌类群的分离方法海洋细菌类群的分离方法第36页/共72页第三十七页，共73页。古菌、细菌和真核生物核糖体小亚基RNA基因(jyn)序列的同源性（%）第37页/共72页第三十八页，共73页。16S rRNA16S rRNA基因（基因（16S rDNA16S rDNA）的特点）的特点1 1 存在于所有的生物细胞中，具有相似的结构和功能存在于所有的生物细胞中，具有相似的结构和功能(gngnng)(gngnng)2 2 具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢3 3 基因中存在进化速率不同的结构区域，交替分布，基因中存在进化速率不同的结构区域，交替分布，互不影响，可用于亲缘关系远近不同的生物之间的互不影响，可用于亲缘关系远近不同的生物之间的系统学研究系统学研究第38页/共72页第三十九页，共73页。16S rRNA 16S rRNA基因基因基因基因(jyn)(jyn)（16S rDNA16S rDNA）的结构模）的结构模）的结构模）的结构模式图式图式图式图通过比较不同微生物16S rDNA序列之间的差别，可能发现某种生物类群(li qn)相关的特征性核苷酸序列或突变，这些特征性核苷酸序列，为各种微生物资源的鉴定、分类建立起一个简单而统一的标准。第39页/共72页第四十页，共73页。大肠杆菌(d chn n jn)r DNA小亚基二级结构模式图第40页/共72页第四十一页，共73页。不依赖微生物分离培养的研究(ynji)方法显微镜直接检查法脂肪酸分析基因序列分析探针杂交分析第41页/共72页第四十二页，共73页。脂肪酸分析(fnx)脂肪酸指纹图谱是细菌分类和鉴定中十分有用的技术，尤其是磷脂酸（phospholipid ester-linker fatty acid，PLFA），不同类群的细菌具有特征性的磷脂酸组成，它们易于从土壤、沉积物等环境样品的微生物细胞中抽提出来，因此可用于评估自然环境包括海洋环境中活的微生物生物量或微生物种群结构.Gruntzig v.,et al.,1985 FEMS Microbiol Ecol.31:147-158第42页/共72页第四十三页，共73页。1 1基因序列分析基因序列分析2 2扩增性扩增性rDNArDNA限制性酶切片段多态性分析（限制性酶切片段多态性分析（ARDRA ARDRA）3 3末端限制性片段长度末端限制性片段长度(chngd)(chngd)多态性（多态性（T-RFLPT-RFLP）4 4变性（或温度）梯度凝胶电泳（变性（或温度）梯度凝胶电泳（DGGE or TGGEDGGE or TGGE）5 5rDNArDNA间隔区分析（间隔区分析（RISARISA）6 6荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（FISHFISH）7 7rRNArRNA点点/狭线印迹杂交（狭线印迹杂交（rRNA dot/slot blot)rRNA dot/slot blot)海洋(hiyng)细菌多样性研究中常用的基因分析技术第43页/共72页第四十四页，共73页。基于核糖体RNA基因序列分析(fnx)的流程第44页/共72页第四十五页，共73页。基因序列分析 由于核糖体RNA基因（rDNA）具有高度的保守性，在所有的细胞生物中都存在，且序列不受环境影响，从而成为迄今为止在细菌多样性研究中应用最多的核基因。基本(jbn)研究步骤：（1）环境样品中总DNA的提取和纯化；（2）rDNA的PCR扩增；（3）扩增产物的克隆；（4）克隆产物的序列测定；（5）序列的比较分析和系统学研究。Stahl D.A.,et al.1985 Appl Environ Microbiol.49:1379-1384第45页/共72页第四十六页，共73页。海洋(hiyng)沉积物中DNA提取方法之比较第46页/共72页第四十七页，共73页。扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA)将16S rDNA-PCR技术与RFLP技术相结合而发展起来的微生物多样性研究技术；即采用识别(shbi)4个碱基的限制性内切酶对克隆获得的16S rDNA进行酶切，通过电泳分析酶切后的片段长度多态性。Rooney-Vara J.N.,et al.1998 Syst Appl Microbiol.21:557-568第47页/共72页第四十八页，共73页。末端限制性片段长度多态性(Termanal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)利用一定的标记引物对样品中DNA进行(jnxng)特异扩增，然后进行(jnxng)限制性内切酶酶切，检测末端限制性片段的多态性。Moesender M.M.,et al.1999 Appl Environ Microbiol.65:3518-3525第48页/共72页第四十九页，共73页。变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)使用一对特异性引物PCR扩增环境样品中的16S rRNA基因，产生长度相同但序列不同的DNA片段混合物，该混合物在含梯度浓度变性剂（变性剂浓度由低到高）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，在一定(ydng)温度下，同一变性剂浓度下，序列不同的产物，其解链的温度和程度不同，导致电泳的迁移率不同，从而将不同序列（只要有一个碱基的差别）的DNA分开。Benlloch S.,et al.2002 Environ Microbiol.4(6):349-360第49页/共72页第五十页，共73页。第50页/共72页第五十一页，共73页。rDNA间隔区分析(rDNA internal spacer analysis，RISA)利用16S rDNA 3保守区和23S rDNA 5保守区设计引物，PCR扩增环境样品中的16S-23 rDNA间隔区，通过分析该扩增片段(pin dun)的核苷酸序列或比较其差异，进行微生物多样性研究。Garca-Martnez J.et al.1999 J Microbiol Method 36:55-64第51页/共72页第五十二页，共73页。16S 23s rDNA间隔(jin g)区示意图第52页/共72页第五十三页，共73页。荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH)将荧光标记(bioj)的具有属种（或类群）特异性的寡核苷酸探针与经固定的环境样品中的DNA或RNA进行杂交，并通过扫描共聚焦显微镜（scanning confocal laser microscopy，SCLM）检测杂交信号。该技术广泛应用于环境中特定微生物的种群鉴定、种群数量分析及特异微生物跟踪检测。Ravenschlag K.,et al.2000 Appl Environ Microbiol 66:3592-3602 第53页/共72页第五十四页，共73页。用于海洋细菌多样性分析的探针1 基于不同的域、科、属、种乃至亚种核糖体RNA基因（rDNA）设计的特异性探针2 针对海洋特有细菌类群设计的寡核苷酸探针3 针对某些特殊(tsh)生理类群细菌核糖体RNA或功能基因设计的寡核苷酸探针第54页/共72页第五十五页，共73页。海洋特有细菌(xjn)类群的16S rDNA 探针第55页/共72页第五十六页，共73页。基因芯片技术在海洋细菌多样性分析(fnx)中的应用第56页/共72页第五十七页，共73页。Eilers et al.（2000）：对德国北海浮游细菌的研究表明，培养获得的两个优势细菌类群（Roseobacter和Cytophaga-Flavobacterium）中，前者在16S rDNA克隆文库(wnk)中找到了相关序列，而后者没有；Webster et al.（2001）：从海绵共生体中获得的16S rDNA克隆文库(wnk)中，没有序列与分离培养获得的共生细菌16S rDNA序列相似；Acinas et al.（1999）：海水浮游细菌16S rDNA克隆文库(wnk)中优势类群SAR86 cluster，目前没有在任何可培养的细菌中发现；study（2002）：南沙沉积物16S rDNA克隆文库(wnk)中，没有序列与分离培养获得的细菌16S rDNA序列相似第57页/共72页第五十八页，共73页。新 技 术=新 发 现第58页/共72页第五十九页，共73页。SAR11SAR11vvGiovannoni SJ.,et al.1990 Genetic diversity in Sargasso Sea Giovannoni SJ.,et al.1990 Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton.bacterioplankton.NatureNature 345(6270):60-63 345(6270):60-63vvBritschgi TB.,Giovannoni SJ.1991 Phylogenetic analysis of a natural Britschgi TB.,Giovannoni SJ.1991 Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing.Appl Environ Microbiol 57(6):1707-1713sequencing.Appl Environ Microbiol 57(6):1707-1713vvField KG.,et al.1997 Diversity and depth-spcecific distribution of Field KG.,et al.1997 Diversity and depth-spcecific distribution of SAR11 cluster rRNA genes from marine planktonic bacteria.Appl SAR11 cluster rRNA genes from marine planktonic bacteria.Appl Environ Microbiol 63(1):63-70Environ Microbiol 63(1):63-70vvConnon SA.,Giovannoni SJ.2002 High-throughput methods for Connon SA.,Giovannoni SJ.2002 High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates.Appl Environ Microbiol 68(8):3878-3885new marine isolates.Appl Environ Microbiol 68(8):3878-3885vvRappe MS.,et al.2002 Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine Rappe MS.,et al.2002 Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade.bacterioplankton clade.NatureNature 418(6898):630-633 418(6898):630-633vvMorris RM.,et al.2002 SAR11 clade dominates ocean surface Morris RM.,et al.2002 SAR11 clade dominates ocean surface bacterioplankton communities.bacterioplankton communities.Nature Nature 420(6917):806-810 420(6917):806-810第59页/共72页第六十页，共73页。关于海洋细菌关于海洋细菌(xjn)多样性研多样性研究究若干问题的讨论若干问题的讨论第60页/共72页第六十一页，共73页。Marine Microorganisms as a Biomedical Source:Are They Unculturable or Uncultured?第61页/共72页第六十二页，共73页。Uphoff et al.(2001)：设计了12种不同的培养基，与12种不同的培养条件搭配对，对海洋浮游细菌进行研究，得到(d do)了属-Proteobacteria、-Proteobacteria、high-GC Gram-positives以及Cytophaga/Flavobacterium/Bacteroides等类群的细菌；Eilers et al.（2000）：改进培养方法，获得一些海洋细菌，这些细菌的16S rDNA序列表明它们与西太平洋一类尚未培养的细菌类群NOR1一致；Eilers et al.（2001）：分离获得了全球分布的原来未获培养的属-Proteobacteria的NOR5细菌类群；Webster et al.（2001）：应用新的分离培养方法，从海绵中得到(d do)了与FISH的结果具有较大的一致性的共生细菌的类群；Joulian et al.（2001）：培养获得的硫酸盐还原细菌与克隆文库中部分序列所代表的属种是一致的。第62页/共72页第六十三页，共73页。在对陆地环境细菌多样性的比较研究中，来自克隆文库的序列与从同样生境中获得的分离培养物16S rDNA序列往往具有较高的相似性；海洋细菌目前的不能培养，更多的原因在于人们对海洋细菌的认识比之陆地微生物要缺乏得多；相信随着(su zhe)了解的深入，它们是可以获得培养的。第63页/共72页第六十四页，共73页。What is Marine Bacteria?第64页/共72页第六十五页，共73页。Gray et al.Appl Environ Microbiol.1999,62(11):4049-4059 (Puget Sound,Wash.)第65页/共72页第六十六页，共73页。摘自Eilers et al.Appl Environ Microbiol.2000 66(7):3044-3051第66页/共72页第六十七页，共73页。第67页/共72页第六十八页，共73页。来自海洋细菌16S rRNA基因特征性序列的发现，为我们从分子水平上界定海洋细菌提供了依据，随着海洋细菌16S rRNA基因数据库的丰富，人们(rn men)将能够进一步建立用于判断不同系统类群、不同属种海洋细菌的分子标准。第68页/共72页第六十九页，共73页。What is Next?第69页/共72页第七十页，共73页。v 海洋细菌(xjn)在海洋物质循环乃至生命起源过程中的作用和意义v 海洋细菌(xjn)的代谢调控v 特定生理类群细菌(xjn)的多样性及其系统进化v 海洋细菌(xjn)功能产物的产业化第70页/共72页第七十一页，共73页。第71页/共72页第七十二页，共73页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第72页/共72页第七十三页，共73页。