5.3血红蛋白的提取和分离.pptx

思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。第1页/共50页思考思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构第2页/共50页第3页/共50页（一）（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.2.凝胶：凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂（如葡聚糖或琼脂糖）构成的微小多孔球体糖）构成的微小多孔球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道。通道。根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量的大小，的大小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。1.1.概念：概念：一、基础知识第4页/共50页3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第5页/共50页第6页/共50页第7页/共50页 1、概念：在一定的范围内，能对抗、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起或稍加稀释不引起溶液溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶液的）对溶液的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液第8页/共50页3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对？思考：说出人体血液中缓冲对？NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3第9页/共50页1、概念：指带电粒子在电场作用下发生、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。迁移的过程。（三）（三）电泳：电泳：第10页/共50页 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下下，这些基团会带上（，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（着与其（）移动。移动。3、本质：电泳利用了待分离样品中各、本质：电泳利用了待分离样品中各种分子种分子（）以及分子本以及分子本身身（）、（）、（）的不同，使带的不同，使带电分子产生不同的（电分子产生不同的（），从而），从而实现样品中各种分子的分离。实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH第11页/共50页第12页/共50页（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成聚合交联成三维网状结构的凝胶三维网状结构的凝胶 4.分类：分类：两种常用的电泳方法两种常用的电泳方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。（2 2 2 2）原理原理 第13页/共50页为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单的作用下会解聚成单条肽链，条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复复合物，合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小SDS注意：测定（注意：测定（）通）通常用十二烷基磺酸钠（常用十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量第14页/共50页二、二、实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：(一）一）.样品处理和粗分离样品处理和粗分离血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90第15页/共50页第16页/共50页第17页/共50页每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。第18页/共50页 思考：（材料的选取）用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第19页/共50页目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）1.红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯第20页/共50页洗涤过程图解洗涤过程图解：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌缓慢搅拌10MIN，（）离心离心.五倍体积五倍体积如此重复洗涤（如此重复洗涤（）次，直至上清液中已没有（）次，直至上清液中已没有（），），表明洗涤干净表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。数过少。三三黄色黄色生理盐水生理盐水低速短时间低速短时间第21页/共50页2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）（）（）体积，再加）体积，再加40体积的（体积的（），置于（），置于（）上）上充分搅拌充分搅拌10分钟分钟,细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白.3.分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第22页/共50页第第1层：（层：（）甲苯层）甲苯层第第2层：层：（）色薄层固体 （）的沉淀层，的沉淀层，第第3层层:（）的液体 （）的水溶液层的水溶液层 第第4层层:其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色第23页/共50页用用 过滤过滤 ，除去，除去 ，于分液漏斗中静置，于分液漏斗中静置片刻后，片刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。滤纸滤纸脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层第24页/共50页.分离血红蛋白分离过程:红细胞混合液高速离心10min 离心管滤纸过滤脂类物质烧杯第25页/共50页取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是（小时，目的是（）或用于更换样品中的（）或用于更换样品中的（）。透）。透析袋一般用析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液4.透析透析（粗分离）（粗分离）1第26页/共50页第27页/共50页思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，它的目的是什么？它的目的是什么？目的是利用缓冲液模拟细胞内的目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）（活性）第28页/共50页小结：样品处理和粗分离1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。去除小分子杂质。第29页/共50页（二).凝胶色谱操作-1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5193.样品的加入和洗脱血红蛋白的纯化血红蛋白的纯化第30页/共50页材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:2.凝胶色谱柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱第31页/共50页3.样品的加入和洗脱第32页/共50页(三）三）.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）做）判断（判断（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化第33页/共50页注意事项1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。为什么？三、操作提示第34页/共50页观察你处理的血液样品离心后是否分层观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），如果分层不明显，），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。蛋白的提取纯度。四、四、实验结果分析与评价实验结果分析与评价第35页/共50页由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除气泡，消除不了时要重新装柱。第36页/共50页知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原 理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组 成作 用蛋白质的提取分离样品处理粗 分 离纯 化纯度鉴定第37页/共50页血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（行（）。）。思考思考样品的粗分离样品的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第38页/共50页血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考思考第39页/共50页练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质第40页/共50页2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较第41页/共50页3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固第42页/共50页5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀第43页/共50页7.7.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（的进行过程可表示为图中哪一个（）B第44页/共50页8.凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为16 cm，有关说法中，正确的是 (多选)（）A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大第45页/共50页9.9.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（因是（）A A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果序，降低分离效果B B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动C C、气泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应D D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密A第46页/共50页10.10.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面的下面B B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D D用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A第47页/共50页11.11.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（操作，其中正确的是（）A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液液 A第48页/共50页12.12.12.12.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是的共同点是()()()()A.A.A.A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.B.B.B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.C.C.C.将酶或细胞固定在凝胶中将酶或细胞固定在凝胶中 D.D.D.D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度13.13.13.13.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是其作用主要是()()()()A.A.A.A.使酶的活性最高使酶的活性最高 B.B.B.B.使蛋白质的活性最高使蛋白质的活性最高 C.C.C.C.维持蛋白质所带的电荷维持蛋白质所带的电荷 D.D.D.D.使蛋白质带上电荷使蛋白质带上电荷14.14.14.14.甲种蛋白质是由一条多肽构成，共有甲种蛋白质是由一条多肽构成，共有100100100100个氨基酸；乙个氨基酸；乙种蛋白质是由三条多肽构成，也含有种蛋白质是由三条多肽构成，也含有100100100100个氨基酸且种类和个氨基酸且种类和数量都相等，若有一凝胶色谱柱能分离出这两种蛋白质，数量都相等，若有一凝胶色谱柱能分离出这两种蛋白质，则洗脱时则洗脱时()()()()A.A.A.A.甲先被洗脱甲先被洗脱 B.B.B.B.乙先被洗脱乙先被洗脱 C.C.C.C.甲乙同时被洗脱甲乙同时被洗脱 D.D.D.D.无法判断无法判断A AC CB B第49页/共50页感谢您的观看。第50页/共50页