实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R染植物细胞的微丝.pptx

实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R染植染植物细胞的微丝物细胞的微丝Triton X-100(Triton X-100(Triton X-100(Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚)作用：作用：作用：作用：非离子去垢剂非离子去垢剂非离子去垢剂非离子去垢剂 适当浓度的适当浓度的适当浓度的适当浓度的Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存；细胞质中的细胞骨架系统可被保存；细胞质中的细胞骨架系统可被保存；细胞质中的细胞骨架系统可被保存；M M M M缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 和磷酸缓冲液作用和磷酸缓冲液作用和磷酸缓冲液作用和磷酸缓冲液作用:清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；EDTAEDTAEDTAEDTA（乙二胺四乙酸）和（乙二胺四乙酸）和（乙二胺四乙酸）和（乙二胺四乙酸）和EGTAEGTAEGTAEGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：（乙二醇双醚四乙酸）作用：（乙二醇双醚四乙酸）作用：（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合CaCaCaCa2 2 2 2，主要是，主要是，主要是，主要是高浓度的高浓度的高浓度的高浓度的CaCaCaCa2 2 2 2可是微管解聚，因此加入可是微管解聚，因此加入可是微管解聚，因此加入可是微管解聚，因此加入EGTAEGTAEGTAEGTA来降低来降低来降低来降低CaCaCaCa2 2 2 2的浓度；的浓度；的浓度；的浓度；戊二醛作用：戊二醛作用：戊二醛作用：戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；考马斯亮兰作用：考马斯亮兰作用：考马斯亮兰作用：考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。第1页/共9页实验的关键：实验的关键：Triton X-100 Triton X-100 Triton X-100 Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如果处理时间太抽提处理的时间很关键，如果处理时间太抽提处理的时间很关键，如果处理时间太抽提处理的时间很关键，如果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂。纤维断裂。纤维断裂。纤维断裂。第2页/共9页一、实验目的掌握观察植物细胞内微丝的方法。掌握观察植物细胞内微丝的方法。掌握观察植物细胞内微丝的方法。掌握观察植物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。第3页/共9页二、实验原理细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1 1 1 1Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细处理细胞，可使细胞膜溶解，而细处理细胞，可使细胞膜溶解，而细处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250R250R250R250染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。第4页/共9页细胞骨架微管微管微丝微丝中等纤维中等纤维第5页/共9页三、材料和试剂材料：新鲜洋葱鳞茎材料：新鲜洋葱鳞茎材料：新鲜洋葱鳞茎材料：新鲜洋葱鳞茎器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸试剂：试剂：试剂：试剂：0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH6.8pH6.8pH6.8pH6.8），），），），1 1 1 1 Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100（用（用（用（用M-M-M-M-缓冲液配制），缓冲液配制），缓冲液配制），缓冲液配制），M-M-M-M-缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，3%3%3%3%戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用戊二醛（用0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制），磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（PBSPBSPBSPBS，pH6.8pH6.8pH6.8pH6.8），），），），0.20.20.20.2考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰R250R250R250R250第6页/共9页四、实验方法与步骤1.1.1.1.取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮作对照，大小皮作对照，大小皮作对照，大小皮作对照，大小1 1 1 12 2 2 2，放入盛有，放入盛有，放入盛有，放入盛有0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液液液液PBSPBSPBSPBS（pH6.8pH6.8pH6.8pH6.8）的青霉素瓶中；）的青霉素瓶中；）的青霉素瓶中；）的青霉素瓶中；2.2.2.2.吸去缓冲液，加入吸去缓冲液，加入吸去缓冲液，加入吸去缓冲液，加入1 1 1 1 Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100处理洋葱内处理洋葱内处理洋葱内处理洋葱内表皮表皮表皮表皮20-30 20-30 20-30 20-30？minminminmin；3.3.3.3.吸吸吸吸Triton X-100Triton X-100Triton X-100Triton X-100，用，用，用，用M-M-M-M-缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液充分清洗充分清洗充分清洗充分清洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3min3min3min3min；4.4.4.4.用用用用3%3%3%3%戊二醛戊二醛戊二醛戊二醛固定固定固定固定20min20min20min20min；5.5.5.5.用用用用PBSPBSPBSPBS清洗清洗清洗清洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次10min10min10min10min；6.6.6.6.0.20.20.20.2考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰R250R250R250R250染色染色染色染色20-30min20-30min20-30min20-30min；7.7.7.7.用用用用蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水清洗清洗清洗清洗1-21-21-21-2次；次；次；次；8.8.8.8.压片，镜检。压片，镜检。压片，镜检。压片，镜检。结果微丝束呈深蓝色结果微丝束呈深蓝色结果微丝束呈深蓝色结果微丝束呈深蓝色第7页/共9页五、实验结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数10201020）左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层第8页/共9页