激光共聚焦技术学习教案.pptx
会计学1激光激光(jgung)共聚焦技术共聚焦技术第一页，共22页。n n激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（LSMLSM）是当今）是当今）是当今）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之世界上最先进的分子生物学分析仪器之世界上最先进的分子生物学分析仪器之世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。一。一。一。n n它是在荧光显微镜成像的基础上加装了它是在荧光显微镜成像的基础上加装了它是在荧光显微镜成像的基础上加装了它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置激光扫描装置激光扫描装置激光扫描装置(zhungzh)(zhungzh)，利用计算机，利用计算机，利用计算机，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发进行图像处理，使用紫外光或激光激发进行图像处理，使用紫外光或激光激发进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微荧光探针，从而得到细胞或组织内部微荧光探针，从而得到细胞或组织内部微荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变细结构的荧光图像，观察细胞的形态变细结构的荧光图像，观察细胞的形态变细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。化或生理功能的改变。n n成为形态学、分子细胞生物学、神经科成为形态学、分子细胞生物学、神经科成为形态学、分子细胞生物学、神经科成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力学、药理学和遗传学等领域中新的有力学、药理学和遗传学等领域中新的有力学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。研究工具。研究工具。研究工具。第1页/共22页第二页，共22页。激光共聚焦激光共聚焦激光共聚焦激光共聚焦(jjio)(jjio)显微镜在生物学中的应用显微镜在生物学中的应用显微镜在生物学中的应用显微镜在生物学中的应用n n原位鉴定细胞或组织内生物原位鉴定细胞或组织内生物原位鉴定细胞或组织内生物原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞大分子、观察细胞及亚细胞大分子、观察细胞及亚细胞大分子、观察细胞及亚细胞形态形态形态形态(xngti)(xngti)结构结构结构结构n n检测核酸检测核酸检测核酸检测核酸n n检测蛋白质细胞定位检测蛋白质细胞定位检测蛋白质细胞定位检测蛋白质细胞定位n n检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡n n细胞器的观察及测定细胞器的观察及测定细胞器的观察及测定细胞器的观察及测定n n检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合n n观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架n n检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯n n检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪n n活体细胞或组织功能的实时活体细胞或组织功能的实时活体细胞或组织功能的实时活体细胞或组织功能的实时(sh sh)(sh sh)动态监测动态监测动态监测动态监测n n实时实时实时实时(sh sh)(sh sh)定量测定细胞定量测定细胞定量测定细胞定量测定细胞内内内内Ca2+Ca2+变化变化变化变化n n测定细胞内测定细胞内测定细胞内测定细胞内pHpH变化变化变化变化n n检测膜电位变化检测膜电位变化检测膜电位变化检测膜电位变化n n检测细胞内活性氧物种的产检测细胞内活性氧物种的产检测细胞内活性氧物种的产检测细胞内活性氧物种的产生生生生n n检测药物等跨膜进入组织或检测药物等跨膜进入组织或检测药物等跨膜进入组织或检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位细胞过程及其定位细胞过程及其定位细胞过程及其定位n n检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移n n检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复第2页/共22页第三页，共22页。荧光荧光(ynggung)显微镜系统显微镜系统n n激光共聚焦显微镜所用的荧激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。微镜相同，但又有其特点。n n需与扫描器连接。使激光能需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检并使样品发射的荧光到达检测器。测器。n n需有光路转换装置。即汞灯需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线与激光转换，同时汞灯光线强度强度(qingd)可调。可调。n n荧光镜座要有防震动装置。荧光镜座要有防震动装置。第3页/共22页第四页，共22页。激光共聚焦显微镜工作(gngzu)原理示意图激光经放大、分光后由物镜聚焦于焦平面上，同时，焦平面上被激光扫描的点F所发出的一定波长(bchng)的荧光通过检测针孔光栏达到检测器，并成像于显示器上，得到相应的荧光图象。第4页/共22页第五页，共22页。激光激光(jgung)共聚焦显微镜基共聚焦显微镜基本操作本操作n n获取共焦图像的步骤获取共焦图像的步骤获取共焦图像的步骤获取共焦图像的步骤n n在在在在 VIS VIS 模式模式模式模式(msh)(msh)中观察样品中观察样品中观察样品中观察样品n n装入装入装入装入 LSM LSM 配置配置配置配置n n扫描图像扫描图像扫描图像扫描图像n n保存图像保存图像保存图像保存图像第5页/共22页第六页，共22页。不同厚度(hud)光切图像第6页/共22页第七页，共22页。Z Z轴扫描轴扫描轴扫描轴扫描(s(s omio)omio)时间系列扫描时间系列扫描时间系列扫描时间系列扫描(s(s omio)Zomio)Z轴扫描轴扫描轴扫描轴扫描(s(s omio)omio)时间系列扫描时间系列扫描时间系列扫描时间系列扫描(s(s omio)omio)Z轴扫描、时间(shjin)系列扫描第7页/共22页第八页，共22页。组织和细胞样品中荧光组织和细胞样品中荧光(ynggung)的来源的来源n n自发荧光自发荧光n n荧光染色荧光染色n n免疫荧光荧光抗体法产生免疫荧光荧光抗体法产生(chnshng)荧荧光光n n外源性荧光物质进入组织细胞内产生外源性荧光物质进入组织细胞内产生(chnshng)荧光荧光n n酶致荧光酶致荧光第8页/共22页第九页，共22页。荧光荧光(ynggung)样品的制备要样品的制备要求求n n荧光标记反应荧光标记反应荧光标记反应荧光标记反应(f(f nyng)nyng)的特异性强、荧光定位准确的特异性强、荧光定位准确的特异性强、荧光定位准确的特异性强、荧光定位准确n n保持样品应有的结构形态完整性保持样品应有的结构形态完整性保持样品应有的结构形态完整性保持样品应有的结构形态完整性n n荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性n n荧光强度适宜荧光强度适宜荧光强度适宜荧光强度适宜n n荧光稳定性好荧光稳定性好荧光稳定性好荧光稳定性好n n样品的荧光分布均匀样品的荧光分布均匀样品的荧光分布均匀样品的荧光分布均匀n n两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除n n图象背景干净、干扰杂质少图象背景干净、干扰杂质少图象背景干净、干扰杂质少图象背景干净、干扰杂质少第9页/共22页第十页，共22页。荧光探针荧光探针(tn zhn)的种类及应用的种类及应用n n原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构胞形态结构胞形态结构胞形态结构n n检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFPGFP、YFPYFP等）等）等）等）n n活体细胞或组织功能的实时动态监测活体细胞或组织功能的实时动态监测活体细胞或组织功能的实时动态监测活体细胞或组织功能的实时动态监测(jin c)(jin c)n n实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+Ca2+变化：变化：变化：变化：fluo-3/AMfluo-3/AM，fura-2fura-2第10页/共22页第十一页，共22页。荧光荧光(ynggung)探针标记样品探针标记样品的过程的过程n n样品预处理样品预处理n n给药、切片或细胞标本给药、切片或细胞标本(biobn)的制备的制备n n荧光探针标记样品荧光探针标记样品第11页/共22页第十二页，共22页。百合百合(bih)花粉管钙离子浓度花粉管钙离子浓度梯度检测梯度检测n n液体培养基中培养百合花粉n n观察花粉管生长(shngzhng)情况，长度大概为花粉粒直径的25倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观察。第12页/共22页第十三页，共22页。荧光荧光(ynggung)探针探针n nFluo-3Fluo-3（/AM/AM）n n属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度(nngd)(nngd)。n nFluo-3/AMFluo-3/AM是是fluo-3fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物，的一种乙酸甲酯衍生物，fluo fluo 3/AM3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉被水解脱掉AMAM后，变成游离的后，变成游离的fluo-3fluo-3，因其不具备，因其不具备跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。n n游离配体形式的游离配体形式的fluo-3fluo-3是非荧光性的，但是当它与是非荧光性的，但是当它与Ca2Ca2结合后，形成具有荧光的结合后，形成具有荧光的fluo-3-Cafluo-3-Ca，是细胞荧，是细胞荧光强度增加光强度增加4040至至8080倍，而且其荧光强度与细胞内倍，而且其荧光强度与细胞内Ca2Ca2 呈正相关，因此可以得到呈正相关，因此可以得到Ca2Ca2浓度浓度(nngd)(nngd)。n n另外另外Fluo 3Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙也有作用。形式的钙也有作用。第13页/共22页第十四页，共22页。save “projection”Projection第14页/共22页第十五页，共22页。图710.7.连续(linx)降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示冬小麦胞内荧光有相同的变化趋势。8.连续(linx)降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示春小麦胞内荧光有相同的变化趋势。9.Fluo-3/AM染色后,静息态下冬小麦原生质体的三维重组图像。10.Fluo-3/AM染色后,静息态下春小麦原生质体的三维重组图像。刘炜等，低温处理对冬、春小麦细胞Ca2+时空(sh kn)变化的影响，植物学报，2001，43(12):1218 1223第15页/共22页第十六页，共22页。第16页/共22页第十七页，共22页。目的目的(md)蛋白细胞器定位观察蛋白细胞器定位观察n n含有荧光(ynggung)蛋白的载体pA7-GFPn n目的基因n n洋葱表皮第17页/共22页第十八页，共22页。XbaI,SmaI,BamHI目的蛋白细胞器定位目的蛋白细胞器定位(dngwi)观察观察n n含有(hn yu)荧光蛋白的载体pA7-GFPCaMV 35S PromoterXhoI,NcoI,SalI,SpeIGFPn目的(md)基因第18页/共22页第十九页，共22页。目的蛋白目的蛋白(dnbi)细胞器定位观细胞器定位观察察对提取(tq)的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段已经和质粒DNA重组。图3-9 pA7-TTG1重组(zhn z)质粒酶切鉴定及 PCR鉴定酶切：重组(zhn z)质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组(zhn z)质粒PCR产物第19页/共22页第二十页，共22页。目的目的(md)蛋白细胞器蛋白细胞器定位观察定位观察含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 L分别加入1.5 mL离心管中，分别加入 500 L的蒸馏水，两管分别标号 P1，P2。(2)分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入 P1，P2。(3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共(ygng)抽三次。(5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在 MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。第20页/共22页第二十一页，共22页。目的蛋白细胞器定位目的蛋白细胞器定位(dngwi)观察观察 Bright GFP Merged TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达(biod)检测A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达(biod)；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达(biod)；A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞35S:GFP a b c35S:BrTTG1-GFPdef第21页/共22页第二十二页，共22页。
