实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目蛋白质.pptx

会计学1实验七亲和层析纯化和实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目鉴定目蛋白质蛋白质实验目的实验目的n n掌握掌握掌握掌握GSTGST亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分）和实验方法（第一部分）和实验方法（第一部分）和实验方法（第一部分）n n掌握掌握掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方法（第二部分）法（第二部分）法（第二部分）法（第二部分）第1页/共38页第一部分第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋亲和层析纯化目的蛋白白第2页/共38页亲和层析原理亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共生物大分子与配体特异非共价结合。价结合。n n酶酶-底物或底物类似物（竞争性底物或底物类似物（竞争性抑制剂）抑制剂）n n抗体抗体-抗原抗原n n激素激素-受体受体n n外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细多糖、糖蛋白、细胞表面受体胞表面受体n n核酸核酸-互补序列（互补序列（Oligo-dT）第3页/共38页亲亲和和层层析析原原理理第4页/共38页第5页/共38页第6页/共38页GSH-Sepharose 4B第7页/共38页GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B第8页/共38页GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B第9页/共38页亲和层析流程亲和层析流程第10页/共38页第一部分第一部分 实验步骤实验步骤第11页/共38页一、细胞破碎一、细胞破碎一、细胞破碎一、细胞破碎n n3600 mL诱导的菌液，离心分装诱导的菌液，离心分装到到12只只50 mL离心管，离心管，-20保存；保存；（每个班用（每个班用2管）管）n n每管加每管加30 mL PBS缓冲液，混匀；缓冲液，混匀；n n超声超声3S，暂停，暂停5S，持续，持续15 min；n n4，10000 rpm，离心，离心10 min；n n取取50 uL上清，作为纯化前的样品；上清，作为纯化前的样品；n n每组取每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。上清液，上柱纯化。第12页/共38页二、装二、装二、装二、装GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B柱柱柱柱1.清洗和装好层析柱，封闭出口；清洗和装好层析柱，封闭出口；2.加入加入2 mL PBS；3.取取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中；加入柱子中；4.打开柱子出口，使打开柱子出口，使PBS缓慢流缓慢流出。出。注意：始终保持柱内的液面高于注意：始终保持柱内的液面高于注意：始终保持柱内的液面高于注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B GSH-Sepharose 4B 第13页/共38页三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白1.1.用用用用5 mL PBS5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复3 3遍。遍。遍。遍。2.2.将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液2-3 mL2-3 mL加到柱子中。加到柱子中。加到柱子中。加到柱子中。3.3.用用用用5 mL PBS5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复3 3遍。遍。遍。遍。4.4.加入加入加入加入1.0 mL 1.0 mL 洗脱液。洗脱液。洗脱液。洗脱液。5.5.用用用用1.5 mL1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集离心管收集洗脱液，每管收集离心管收集洗脱液，每管收集离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL0.2 mL（3-43-4滴），共收集滴），共收集滴），共收集滴），共收集5 5管。管。管。管。6.6.用用用用5 mL PBS 5 mL PBS 缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子3 3遍，关闭出口。遍，关闭出口。遍，关闭出口。遍，关闭出口。7.SDS-PAGE7.SDS-PAGE检测第检测第检测第检测第2 2和和和和3 3管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。第14页/共38页四、四、四、四、SDS-PAGESDS-PAGE样品制备样品制备样品制备样品制备1号：过柱前的蛋白溶液号：过柱前的蛋白溶液80 uL2号：收集的蛋白溶液（号：收集的蛋白溶液（2号管）号管）80 uL3号：收集的蛋白溶液（号：收集的蛋白溶液（3号管）号管）80 uL 1-3号分别加入号分别加入20 uL 5上上样缓冲液，混匀后在沸水中样缓冲液，混匀后在沸水中加热加热3 min。第15页/共38页 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加样品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16页/共38页亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂n nPBS（pH 7.4）:NaCl（58.5）40 g；KCl（74.5）1.0 g；KH2PO4（136.09）1.2 g；Na2HPO412H2O（358.14）18.1 g；加水定容到加水定容到5000 mL。第17页/共38页亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂n n50 mM Tris-HCl（pH 8.0）:Tris（121.14）6.055 g，溶于，溶于900 mL水，用水，用HCl调调pH到到8.0，用水，用水定容至定容至1000 mL。n n洗脱液洗脱液:还原型谷胱甘肽（还原型谷胱甘肽（307.32）0.15366 g，溶于溶于50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。中。第18页/共38页第二部分第二部分SDS-PAGE检测目的蛋白质检测目的蛋白质第19页/共38页实验目的实验目的n n掌握掌握掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法n n掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法第20页/共38页n n蛋白质与蛋白质与SDS按按1:1.4比例形成复比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。间原有的电荷差异。n n蛋白质的迁移速度只取决于分子蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。大小。n n在在15-200 KD之间，蛋白质的迁之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理实验原理第21页/共38页第22页/共38页 连续系统：连续系统：连续系统：连续系统：电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液pHpH值及凝胶浓值及凝胶浓值及凝胶浓值及凝胶浓度相同。度相同。度相同。度相同。（电荷效应、分子筛效应）（电荷效应、分子筛效应）（电荷效应、分子筛效应）（电荷效应、分子筛效应）不连续系统：不连续系统：不连续系统：不连续系统：缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pH、凝胶浓、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。度及电位梯度的不连续性。（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）第23页/共38页1.凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性（2种孔径）种孔径）2.缓冲液离子成分及缓冲液离子成分及pH值的不连续性值的不连续性（2种种缓冲体系，缓冲体系，3种种pH）：浓缩胶，）：浓缩胶，pH6.8，蛋白，蛋白质分子的迁移率比质分子的迁移率比Cl-低，比低，比Gly高。高。浓缩效应浓缩效应第24页/共38页3.电位梯度不连续性：电位梯度不连续性：快离子（快离子（Cl-）后面）后面形成高电位梯度区，慢离子（形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。小的中间层。浓缩效应浓缩效应第25页/共38页实验步骤实验步骤1.1.洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；2.2.制作制作制作制作12%12%分离胶分离胶分离胶分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入。按下表顺序加试剂，混匀，加入。按下表顺序加试剂，混匀，加入。按下表顺序加试剂，混匀，加入 玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；3.3.用用用用1 mL1 mL蒸馏水封住液面，室温蒸馏水封住液面，室温蒸馏水封住液面，室温蒸馏水封住液面，室温30 min30 min，分离胶与水，分离胶与水，分离胶与水，分离胶与水之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；4.4.配制配制配制配制5%5%浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，静置静置静置静置30 min30 min；第26页/共38页12%分离胶分离胶试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O2.5 mL30%Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10%SDS75 uLTEMED（加速剂）（加速剂）10 uL10%AP（催化剂，最后加）（催化剂，最后加）75 uL总体积总体积7.5 mL第27页/共38页试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O3.4 mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL总体积总体积5.0 mL5%5%浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶 第28页/共38页5.5.将胶板放入电泳槽，加入将胶板放入电泳槽，加入将胶板放入电泳槽，加入将胶板放入电泳槽，加入1Tris-Gly1Tris-Gly电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子；轻轻拔掉梳子；轻轻拔掉梳子；轻轻拔掉梳子；6.6.点样：点样：点样：点样：每个样点每个样点每个样点每个样点30 uL30 uL，MarkerMarker点点点点15 uL15 uL；7.7.电泳：电泳：电泳：电泳：100 V100 V，约约约约20 min20 min，样品进入分离胶后，将，样品进入分离胶后，将，样品进入分离胶后，将，样品进入分离胶后，将电电电电 压调到压调到压调到压调到130 V130 V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停 止电泳；止电泳；止电泳；止电泳；实验步骤实验步骤第29页/共38页8.拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑料盒内，加入染色液，离胶放入塑料盒内，加入染色液，振荡振荡30 min；9.回收染色液，加水清洗，用微波回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮炉高火煮 4-5 min，重复，重复2-3次；次；10.观察胶中的蛋白质条带。观察胶中的蛋白质条带。实验步骤实验步骤第30页/共38页 纯化前纯化前 纯化后纯化后 MarkerMarker第31页/共38页实验试剂实验试剂 蛋白质分子量标准蛋白质分子量标准蛋白质分子量标准蛋白质分子量标准 兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶B 97400 B 97400 B 97400 B 97400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白 66200662006620066200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白 43000430004300043000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 31000310003100031000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 20100201002010020100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 14400144001440014400第32页/共38页实验结果实验结果绘制标准曲线：绘制标准曲线：log MW=K-bm 蛋白质区带中心至分离胶上沿距离蛋白质区带中心至分离胶上沿距离蛋白质区带中心至分离胶上沿距离蛋白质区带中心至分离胶上沿距离相对迁移率相对迁移率相对迁移率相对迁移率 =溴酚蓝至分离胶上沿距离溴酚蓝至分离胶上沿距离溴酚蓝至分离胶上沿距离溴酚蓝至分离胶上沿距离 蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移率作横坐标，做标准曲线。根据率作横坐标，做标准曲线。根据率作横坐标，做标准曲线。根据率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白目的蛋白目的蛋白目的蛋白的迁移的迁移的迁移的迁移率以及标准曲线，可以计算相对分子量。率以及标准曲线，可以计算相对分子量。率以及标准曲线，可以计算相对分子量。率以及标准曲线，可以计算相对分子量。第33页/共38页SDS-PAGESDS-PAGE试剂试剂试剂试剂1.30%（W/V）凝胶液）凝胶液：丙烯酰胺：丙烯酰胺（Acr）29.0 g，亚甲基双丙烯，亚甲基双丙烯酰胺（酰胺（Bis）1.0 g，加水到，加水到100 mL。2.分离胶缓冲液（分离胶缓冲液（pH8.8，1.0 mol/L Tris-HCl）：三羟甲基氨基甲烷：三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1 g，加，加80 mL蒸馏水，蒸馏水，用用1.0 mol/L HCl调节调节pH到到8.8，用蒸馏水稀释到用蒸馏水稀释到100 mL。第34页/共38页3.浓缩胶缓冲液（浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）Tris 12.1 g，加，加60 mL蒸馏水，用蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节调节pH到到6.8，加蒸，加蒸馏水到馏水到100 mL。4.10%（W/V）SDS5.10%（W/V）过硫酸铵）过硫酸铵（现用现（现用现配）配）第35页/共38页6.10电极缓冲液（电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到加水到1000 mL。（用时稀释（用时稀释10倍）倍）7.蛋白质标准溶液蛋白质标准溶液：低分子量蛋白：低分子量蛋白质标准，加质标准，加200 uL水溶解，加水溶解，加50 uL上样缓冲液。上样缓冲液。第36页/共38页8.上样缓冲液（上样缓冲液（5）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油，甘油40 mL，巯基乙醇，巯基乙醇20 mL，SDS 8.0 g，溴酚蓝，溴酚蓝0.005 g，体积，体积100 mL。9.染色液染色液：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇（乙醇），甲醇（乙醇），80 mL冰乙酸，冰乙酸，670 mL水水。10.脱色液脱色液：50 mL甲醇，甲醇，75 mL冰冰乙酸，乙酸，875 mL水。水。第37页/共38页