毛细管电泳 优秀课件.ppt

毛细管电泳 第1页，本讲稿共27页 毛细管电泳（capillary electrophoesis,CE)也称高效毛细管电泳（HPCE），是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品离子和分子的淌度或（和）分配行为上的差异而对其进行分离分析的新型电泳技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。第2页，本讲稿共27页 特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min3.1min内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.14.1minmin内分离内分离了了2424种阳离子；分离柱效：种阳离子；分离柱效：10105 510107 7/m m理论塔板数；理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；进样量极少，水介质中进行；4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；第3页，本讲稿共27页 电场强度 也称电位梯度，指单位长度（厘米）支持物体上/溶液介质中的电位降。在CE中，电场强度等于某匀质电解质溶液所承受的电压除以该溶液在毛细管中充盈的长度，它对带电粒子的电泳起着十分重要的作用。第4页，本讲稿共27页电泳 带电悬浮颗粒或大电子在直流电场作用下，于一定介质（溶剂）中发生定向移位运动的物理化学现象，也称为电迁移。电泳的方向由粒子所带电荷决定，带正电的粒子向负极移动，而带负电的粒子则向正极运动。颗粒或大分子的迁移速度取决于电势差、颗粒带电量、颗粒大小、形状、电解质溶液的PH、黏度等。电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外，还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后，两种力的作用就会达到平衡，此时离子作匀速运动，电泳进入稳态。第5页，本讲稿共27页何为双电层？双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的。双电层是与表面异号的离子层，凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。在毛细管电泳中，无论是带电粒子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。第6页，本讲稿共27页 双电层 当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层 固体与液体接触时，固体表面分子在液体中极性分子和离子的作用下可发生解离，并在固体界面上形成定域电荷。定域电荷吸附溶液中的离子，在固-液界面上形成双电层。第7页，本讲稿共27页 电渗也称电渗流，指毛细管柱内溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。交界面形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。电渗发生时，吸附层粒子固定不动，扩散层粒子带动毛细管中的溶液单向运动。方向决定于扩散层荷电粒子种类，带正电向阴极移动，带正电向阳极移动速度与定域电荷、Zeta电位大小成正比，Zeta电位为0，速度也为0.第8页，本讲稿共27页淌度电泳淌度，单位电场作用下在溶液中粒子的电泳速度 一定分析条件下，主要决定于荷电种类、粒子数量、形状、大小、溶液PH等。粒子带净电荷越多，直径越小，形状越接近球形，其电泳淌度越大。中性粒子电泳淌度为0.电渗淌度，单位电场作用下在溶液中粒子的电渗速度。是溶液的电渗作用以及粒子与固定相（如凝胶、填充固定相等）或溶液中的某些组分（如胶束、环糊精等）相互作用的综合结果。与电场强度、毛细管材料、毛细管中溶液组成、浓度、PH、黏度、离子强度、添加剂等有关。表观淌度，单位电场作用下在溶液中粒子的实际迁移速度。为电泳淌度与电渗淌度的矢量和。一定条件下，可获得必点用速度高出一个数量级的电渗流。淌度为粒子的特征性参数，是CE分离的基础。第9页，本讲稿共27页 分离的原因分离的原因：电泳迁移，电渗迁移 电泳迁移：在高压电场下，带电离子向相反的方向移动。电渗迁移：当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。第10页，本讲稿共27页 分离 第11页，本讲稿共27页HPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；产生的电渗流大小不同；第12页，本讲稿共27页影响毛细管电泳分离效果的主要因素缓冲溶液的组成:如若形成络合物，使电渗淌度发生改变，提高分离效果。缓冲溶液的浓度:在恒定PH下，电渗淌度随电解质浓度的增加而减小，改善分离效果。缓冲溶液的pH：1.对毛细管内壁定域电荷的多少有影响 2。对于有等电点的物质，影响有效电荷。弱电解质则直接影响化学平衡而影响分离 缓冲溶液的添加剂：加入适当添加剂，控制电渗流的大小与方向，抑制管壁的吸附作用，增加疏水组分的溶解度，扩大分离对象，增加溶液粘度，降低电流，优化分离条件。第13页，本讲稿共27页 常见毛细管电泳类型及原理 毛细管区带电泳CZE 胶束电动毛细管色谱MEKC 毛细管凝胶电泳CGE 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管电色谱CEC 第14页，本讲稿共27页 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳中，带电粒子的运动速度等于电泳速度和电渗速度的矢量和，电渗速度一般大于电泳速度，因此即使是阴离子也会从阳极端流向阴极端。第15页，本讲稿共27页胶束电动毛细管色谱MEKC 胶束电动毛细管色谱MEKC指以加入了一定浓度表面活性剂的电解质溶液为介质的电泳，适宜分析电中性组分。通常选择加阴离子表面活性剂到缓冲溶液中，当浓度超过临界胶束浓度，表面活性剂分子间的疏水基团聚集在一起，形成胶束。因为样品中不同组分具有不同疏水性，使其进入胶束的机会不同，从而产生分配系数差异。疏水性越强的组分出峰时间越长。第16页，本讲稿共27页毛细管凝胶电泳CGE毛细管凝胶电泳CGE，以凝胶或聚合物网络为介质的毛细管电泳。分离范围：从几个碱基对到几百万个碱基对的以及蛋白质等大分子物质。消除电泳：毛细管改性，使粒子只产生电泳。介质分类：凝胶和线性聚合物不足：凝胶毛细管柱的制备比较繁琐，使用寿命短。第17页，本讲稿共27页毛细管等电聚焦CIEF 等电点:两性物质以电中性状态存在时的p，如氨基酸、蛋白质等，因为在等电点时组分成电中性，所以其电泳淌度为零，且溶解度最好。毛细管等电聚焦（CIEF）：是一种以两性电解质为介质，根据等电点差别分离生物大分子的高分辨电泳。首先，通过管壁涂层使定域电荷最小，以防止蛋白质依附及破坏稳定的聚焦区带。在高电压下，建立p梯度。溶质在低于其等电点的区域呈正电性，向负极方向移动。反之，向正极移动，最后实现分离。第18页，本讲稿共27页毛细管电色谱CEC 毛细管电色谱CEC：一种使用了特殊毛细管柱的毛细管区带电泳，即用填充柱、整体柱或壁处理柱代替了开口毛细管柱。毛细管电色谱综合了电泳和分配色谱两种分离机制，既能分离带电组分，又能分析中性分子，还可用于微量制备。第19页，本讲稿共27页仪器装置 毛细管电泳仪的装置较简单，主要由高压电源、毛细管、缓冲溶液、检测器、工作站等部分组成。高级的仪器还具有自动进样装置、柱温箱、馏分收集器、压力系统和全自动控制仪器的工作站。第20页，本讲稿共27页仪器装置高压电源：电压强度一般控制在150-400V/cm毛细管:长度 20cm 内径 50*10-6、75*10-6 可分为涂层，和未涂层两种。检测器:可调波长的紫外检测器进样装置：分为压力、重力、电动三种进样方式压力系统：在毛细管两端加压：防止气泡产生 在毛细管一端加压：可以在不使用电压时进行毛细管高效 液相色谱分析。温控系统：15-60，浮动小于0.1.第21页，本讲稿共27页定性定量分析 定性参数：迁移时间或相对迁移时间。通过与标准品比对或增加峰高法进行定性分析。定量参数：峰高。在复杂体系中可用内标法或标准加入法进行定量分析。第22页，本讲稿共27页 色谱图色谱峰中的几个参数 1 保留值 2 峰高H及峰面积A 3 区域宽度：峰宽及半峰宽第23页，本讲稿共27页应用应用离子分析离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；迁移方向和电渗流方向一致；4.5 4.5minmin内分离了内分离了2424种金属离子；种金属离子；阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度；第24页，本讲稿共27页阴离子分析阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：质量小、电荷密度大的离子如：SOSO4 4-2-2、ClCl-、F F-等，电泳速率大于电渗流，等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在在3.13.1minmin内分离内分离3636种阴离子；阴极进样，种阴离子；阴极进样，阳极检测；阳极检测；离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析；第25页，本讲稿共27页药物分析药物分析 检测体液或细胞中某检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的作为临床诊断糖尿病的辅助手段；辅助手段；采用毛细管区带电采用毛细管区带电泳方式，在泳方式，在1111minmin内分内分离离1717种药物；种药物；第26页，本讲稿共27页氨基酸与蛋白质分析氨基酸与蛋白质分析采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；第27页，本讲稿共27页