原生质体的分离、融合与培养课件.ppt
大连理工大学 环境与生命学院实验十二实验十二 原生质体的分离、原生质体的分离、融合与培养融合与培养 指导教师：唐颖指导教师：唐颖大连理工大学 环境与生命学院1.1.实验目的实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。本原理。掌握植物原生质体分离、融合和培养的基掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。本过程。大连理工大学 环境与生命学院2.2.实验原理实验原理大连理工大学 环境与生命学院概述概述 物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为作物改良的有力工具之一。作物改良的有力工具之一。作物改良的有力工具之一。作物改良的有力工具之一。植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露裸露裸露裸露细胞细胞细胞细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。大连理工大学 环境与生命学院原生质融合原生质融合 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇明行之有效的融合方法是聚乙二醇明行之有效的融合方法是聚乙二醇明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)(PEG)(PEG)(PEG)法、高法、高法、高法、高CaCaCaCa高高高高pHpHpHpH法和电融合法：法和电融合法：法和电融合法：法和电融合法：PEGPEGPEGPEG作为一种高分子化合物，作为一种高分子化合物，作为一种高分子化合物，作为一种高分子化合物，2020202050505050的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高CaCaCaCa高高高高pHpHpHpH法进行清洗使原生质体融法进行清洗使原生质体融法进行清洗使原生质体融法进行清洗使原生质体融合得以完成。合得以完成。合得以完成。合得以完成。PEGPEGPEGPEG诱导融合的机理：诱导融合的机理：诱导融合的机理：诱导融合的机理：PEGPEGPEGPEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当合物等一些正极化基团能形成氢键，当合物等一些正极化基团能形成氢键，当合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEGPEGPEGPEG分子足够长时，可作为邻近原生质分子足够长时，可作为邻近原生质分子足够长时，可作为邻近原生质分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。表面之间的分子桥而使之粘连。表面之间的分子桥而使之粘连。表面之间的分子桥而使之粘连。PEGPEGPEGPEG也能连接也能连接也能连接也能连接Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+等阳离子，等阳离子，等阳离子，等阳离子，Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+可在一些负可在一些负可在一些负可在一些负极化基团和极化基团和极化基团和极化基团和PEGPEGPEGPEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的膜上的膜上的膜上的PEGPEGPEGPEG分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱和再分布从而引起原生质分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱和再分布从而引起原生质分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱和再分布从而引起原生质分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱和再分布从而引起原生质体融合：高体融合：高体融合：高体融合：高CaCaCaCa高高高高pHpHpHpH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。大连理工大学 环境与生命学院原生质体融合后培养原生质体融合后培养原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。最关键的环节。最关键的环节。最关键的环节。大连理工大学 环境与生命学院3.3.实验材料、用品实验材料、用品实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：黄瓜种子。黄瓜种子。黄瓜种子。黄瓜种子。实验用品：实验用品：实验用品：实验用品：实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、200200200200目滤网、解目滤网、解目滤网、解目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2m0.2m0.2m0.2m滤膜、滤滤膜、滤滤膜、滤滤膜、滤器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台。超静工作台。超静工作台。超静工作台。大连理工大学 环境与生命学院试剂：试剂：(1)(1)(1)(1)酶液酶液酶液酶液 (2)PEG(2)PEG(2)PEG(2)PEG融合液融合液融合液融合液(3)13(3)13(3)13(3)13CPWCPWCPWCPW洗液洗液洗液洗液1 1纤维素酶纤维素酶纤维素酶纤维素酶1 1果胶酶果胶酶果胶酶果胶酶0.7mol/L0.7mol/L甘露醇甘露醇甘露醇甘露醇 0.7mmol/LKH0.7mmol/LKH2 2POPO4 4 10mmol/LCaCl10mmol/LCaCl2 22H2H2 2O O pH6.87.0 pH6.87.0 40%PEG(MW 40%PEG(MW 1500-6000)1500-6000)0.3 mol/L0.3 mol/L葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖3.5mmol/L 3.5mmol/L CaClCaCl2 22H2H2 2OO0.7mm0l/L 0.7mm0l/L KHKH2 2POPO4 4 27272 mg2 mgL L KHKH2 2POPO4 4101.0 mg101.0 mgL KNOL KNO3 3148014800 mg0 mgL L CaClCaCl2 22H2H2 2OO2462460 mg0 mgL L MgSOMgSO4 40 016 mg16 mgL KIL KI0 0025 mg025 mgL L CuSOCuSO4 41313 WWV V甘露醇甘露醇甘露醇甘露醇pH 6.0 pH 6.0(4)20(4)20蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液(5)(5)黄瓜种子萌发与生根培养基黄瓜种子萌发与生根培养基黄瓜种子萌发与生根培养基黄瓜种子萌发与生根培养基（固体）：（固体）：（固体）：（固体）：1/2MS1/2MS（注：（注：（注：（注：MSMS无无无无机成份减半，蔗糖机成份减半，蔗糖机成份减半，蔗糖机成份减半，蔗糖0.2%,0.2%,琼脂琼脂琼脂琼脂0.7%0.7%）(6)(6)黄瓜原生质体形成愈伤组织黄瓜原生质体形成愈伤组织黄瓜原生质体形成愈伤组织黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基培养基培养基培养基(固体和液体固体和液体固体和液体固体和液体)：MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BAMS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA(7)(7)黄瓜原生质体愈伤组织分化黄瓜原生质体愈伤组织分化黄瓜原生质体愈伤组织分化黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基培养基培养基培养基(固体固体固体固体)：MS+5mg/L MS+5mg/L NAANAA(8)(8)无菌蒸馏水无菌蒸馏水无菌蒸馏水无菌蒸馏水(9)0.1%HgCl2(9)0.1%HgCl2大连理工大学 环境与生命学院4.4.实验步骤实验步骤 溶液及培养基的配制溶液及培养基的配制溶液及培养基的配制溶液及培养基的配制 黄瓜无菌苗的培养黄瓜无菌苗的培养黄瓜无菌苗的培养黄瓜无菌苗的培养精选饱满的黄瓜种子，浸种精选饱满的黄瓜种子，浸种精选饱满的黄瓜种子，浸种精选饱满的黄瓜种子，浸种2020202030min30min30min30min后，用后，用后，用后，用0.1%HgCl20.1%HgCl20.1%HgCl20.1%HgCl2表表表表面消毒面消毒面消毒面消毒8 8 8 810min10min10min10min，无菌水洗涤，无菌水洗涤，无菌水洗涤，无菌水洗涤4 4 4 45 5 5 5次，剥皮，种子接入次，剥皮，种子接入次，剥皮，种子接入次，剥皮，种子接入1/2MS1/2MS1/2MS1/2MS培养基中。置于温度培养基中。置于温度培养基中。置于温度培养基中。置于温度252252252252，光照度，光照度，光照度，光照度1000Lx,1000Lx,1000Lx,1000Lx,光照光照光照光照1414141416h/d 16h/d 16h/d 16h/d 的条件下培养。培养时间约的条件下培养。培养时间约的条件下培养。培养时间约的条件下培养。培养时间约1 1 1 1周。周。周。周。大连理工大学 环境与生命学院 原生质体的分离原生质体的分离原生质体的分离原生质体的分离取取取取黄黄黄黄瓜瓜瓜瓜无无无无菌菌菌菌苗苗苗苗子子子子叶叶叶叶，切切切切成成成成薄薄薄薄片片片片后后后后，置置置置于于于于酶酶酶酶液液液液中中中中和和和和摇摇摇摇床床床床上上上上（6060606070rpm70rpm70rpm70rpm），在在在在2525252528282828黑黑黑黑暗暗暗暗条条条条件件件件下下下下，酶酶酶酶解解解解5 5 5 57h,7h,7h,7h,用用用用200200200200目目目目网网网网过过过过滤滤滤滤除除除除去去去去未未未未完完完完全全全全消消消消化化化化的的的的残残残残渣渣渣渣。在在在在1000rpm1000rpm1000rpm1000rpm条条条条件件件件下下下下离离离离心心心心5 5 5 5分分分分钟钟钟钟，弃弃弃弃上上上上清清清清。加加加加入入入入3 3 3 3 4ml 4ml 4ml 4ml l3l3l3l3CPWCPWCPWCPW洗洗洗洗液液液液，相相相相同同同同条条条条件件件件下下下下离离离离心心心心2-52-52-52-5分分分分钟钟钟钟，弃弃弃弃上上上上清清清清，留留留留1ml1ml1ml1ml洗洗洗洗液液液液。用用用用滴滴滴滴管管管管将将将将混混混混有有有有原原原原生生生生质质质质体体体体的的的的1ml1ml1ml1ml洗洗洗洗液液液液吸吸吸吸也也也也，轻轻轻轻轻轻轻轻铺铺铺铺于于于于20202020蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖溶溶溶溶液液液液上上上上(5ml(5ml(5ml(5ml离离离离心心心心管管管管装装装装3m1203m1203m1203m120蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖溶溶溶溶液液液液)，在在在在1000rpm1000rpm1000rpm1000rpm条条条条件件件件下下下下离离离离心心心心510510510510分分分分钟钟钟钟，由由由由于于于于密密密密度度度度梯梯梯梯度度度度离离离离心心心心的的的的作作作作用用用用，生生生生活活活活力力力力强强强强状状状状态态态态好好好好的的的的原原原原生生生生质质质质体体体体漂漂漂漂浮浮浮浮在在在在20202020的蔗糖与的蔗糖与的蔗糖与的蔗糖与13131313 CPWCPWCPWCPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。之间，破碎的细胞残渣沉入管底。之间，破碎的细胞残渣沉入管底。之间，破碎的细胞残渣沉入管底。用用用用200l200l200l200l移液器轻轻将状态好的原生质体吸出移液器轻轻将状态好的原生质体吸出移液器轻轻将状态好的原生质体吸出移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗注意尽可能不要吸入下层的蔗注意尽可能不要吸入下层的蔗注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液糖溶液糖溶液糖溶液)，放入另一干净的离心管中加，放入另一干净的离心管中加，放入另一干净的离心管中加，放入另一干净的离心管中加4ml l34ml l34ml l34ml l3CPWCPWCPWCPW洗液，洗液，洗液，洗液，1000rpm1000rpm1000rpm1000rpm离心离心离心离心2-52-52-52-5分钟，弃上清用血球计数板调整原生质体密度为分钟，弃上清用血球计数板调整原生质体密度为分钟，弃上清用血球计数板调整原生质体密度为分钟，弃上清用血球计数板调整原生质体密度为105105105105一一一一106/ml106/ml106/ml106/ml之间。之间。之间。之间。大连理工大学 环境与生命学院 原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合将将将将1-21-21-21-2滴原生质体混合物（密度分别为滴原生质体混合物（密度分别为滴原生质体混合物（密度分别为滴原生质体混合物（密度分别为105105105105一一一一106/ml106/ml106/ml106/ml）滴入）滴入）滴入）滴入小培养皿，静置小培养皿，静置小培养皿，静置小培养皿，静置810810810810分钟。相对方向加入分钟。相对方向加入分钟。相对方向加入分钟。相对方向加入2 2 2 2滴滴滴滴40404040的的的的PEGPEGPEGPEG溶液，静置溶液，静置溶液，静置溶液，静置10101010分钟，依次间隔分钟，依次间隔分钟，依次间隔分钟，依次间隔5 5 5 5分钟加入分钟加入分钟加入分钟加入0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml、1 ml1 ml1 ml1 ml和和和和2 2 2 2 mlmlmlml含含含含13131313甘露醇的甘露醇的甘露醇的甘露醇的CPWCPWCPWCPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液洗液洗涤，注意在第二、三次洗液洗液洗涤，注意在第二、三次洗液洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l l l l一一一一2 2 2 2次即可进行次即可进行次即可进行次即可进行培养：培养：培养：培养：大连理工大学 环境与生命学院 观察观察观察观察两种原生质体加入两种原生质体加入两种原生质体加入两种原生质体加入PEGPEGPEGPEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。膜融合核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。膜融合核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。膜融合核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。培养培养培养培养将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅层培养，在温度层培养，在温度层培养，在温度层培养，在温度252252252252，光照度，光照度，光照度，光照度1000Lx,1000Lx,1000Lx,1000Lx,光照光照光照光照1414141416h/d 16h/d 16h/d 16h/d 的条件下培的条件下培的条件下培的条件下培养，经养，经养，经养，经1-21-21-21-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2 2 2 24mm4mm4mm4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。大连理工大学 环境与生命学院5.5.实验结果实验结果愈伤组织愈伤组织界面法游离植物原生质体界面法游离植物原生质体PEG法诱导原生质体融合法诱导原生质体融合（1）离心前）离心前 （2）离心后）离心后大连理工大学 环境与生命学院6.6.注意事项注意事项清洗时注意勿使原生质体浮起。清洗时注意勿使原生质体浮起。大连理工大学 环境与生命学院7.7.思考题思考题哪些因素会影响原生质体融合哪些因素会影响原生质体融合?
