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色色谱谱基基础础知知识识 第1页，本讲稿共41页一、色一、色一、色一、色谱谱起源起源起源起源 色谱法起源于色谱法起源于色谱法起源于色谱法起源于2020世纪初，世纪初，世纪初，世纪初，19061906年年年年俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家米哈伊茨维特米哈伊茨维特米哈伊茨维特米哈伊茨维特用用用用碳酸钙碳酸钙碳酸钙碳酸钙填充竖立的玻璃管，以填充竖立的玻璃管，以填充竖立的玻璃管，以填充竖立的玻璃管，以石油醚石油醚石油醚石油醚洗脱植物色素的提取洗脱植物色素的提取洗脱植物色素的提取洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为色谱法。将这种方法命名为色谱法。将这种方法命名为色谱法。将这种方法命名为色谱法。第2页，本讲稿共41页石油石油醚醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素色色谱谱组组分分第3页，本讲稿共41页色色谱谱的主要目的是的主要目的是对对混合物中的目混合物中的目标标物分离和定量物分离和定量色谱法：色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：流动相：携带样品流过整个系统的流体携带样品流过整个系统的流体携带样品流过整个系统的流体携带样品流过整个系统的流体固定相固定相：静止不动的一相，色谱柱静止不动的一相，色谱柱静止不动的一相，色谱柱静止不动的一相，色谱柱第4页，本讲稿共41页色谱优点同时分析同时分析分离性能好分离性能好灵敏度高（灵敏度高（ppm-ppb ppm-ppb 微克微克-纳克）纳克）进样量小进样量小 （1-100L1-100L）第5页，本讲稿共41页色谱分类以流动相状态为标准划分类型。用气体作为流以流动相状态为标准划分类型。用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法动相的色谱法称为气相色谱法Gaschromatography GC.Gaschromatography GC.用液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法用液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法 Liquid chromatography LC.Liquid chromatography LC.第6页，本讲稿共41页HPLCVSGC液相色谱：液相色谱：适用于高沸点适用于高沸点 大分子大分子 强极性强极性 热稳定性热稳定性差的化合物的分析，流动相具有运载样品分子差的化合物的分析，流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用和选择性分离的双重作用气相色谱：气相色谱：适用于沸点低，热稳定性好的中适用于沸点低，热稳定性好的中,小化合小化合物的分析。流动相只起到运载样品分子的作用物的分析。流动相只起到运载样品分子的作用第7页，本讲稿共41页HPLCVSGC高效液相色谱法采用高压输液泵输送流动相及特殊规格高效液相色谱法采用高压输液泵输送流动相及特殊规格填料固定相等，分离效能高，应用范围广填料固定相等，分离效能高，应用范围广,如氨基酸如氨基酸 蛋蛋白质白质 生物碱生物碱 维生素维生素 有机酸有机酸 农药，都可用高效液相色谱农药，都可用高效液相色谱法进行分析法进行分析气相色谱法虽然也具有快速气相色谱法虽然也具有快速 分离效率高分离效率高 用样少等优点，但它要用样少等优点，但它要求样品必须能够汽化，从而受到样品的挥发性限制。求样品必须能够汽化，从而受到样品的挥发性限制。第8页，本讲稿共41页HPLCHPLCHPLCHPLC的分离的分离的分离的分离类类类类型型型型正相色正相色谱(NP-HPLC)(NP-HPLC)反相色反相色谱(RP-HPLC)(RP-HPLC)反相离子反相离子对色色谱(RPIC)(RPIC)离子交离子交换色色谱(IEC)(IEC)空空间排阻色排阻色谱(SEC)(SEC)手性化合物分离模式手性化合物分离模式(Chiral (Chiral separation mode)separation mode)第9页，本讲稿共41页液相色谱按两相极性不同分为液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序不同极性的化合物出峰顺序第10页，本讲稿共41页反相反相HPLCHPLC色色谱谱柱柱C18(ODS)type C18(ODS)type C8(octyl)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typeC4(butyl)typePhenyl type Phenyl type TMS typeTMS typeCyano typeCyano type-Si-C18H37SiNon-polar property第11页，本讲稿共41页反向色谱:反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极 性相对较弱官能团的键合相。适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物样品 反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。第12页，本讲稿共41页正相正相HPLCHPLC色色谱谱柱柱 硅胶型硅胶型 氰基型氰基型 氨基型氨基型氨基型氨基型 糖类分析糖类分析 二醇基型二醇基型二醇基型二醇基型 蛋白质分析蛋白质分析蛋白质分析蛋白质分析Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified Si第13页，本讲稿共41页正相色谱：固定相通常为硅胶以及其他具有极正相色谱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团，如（性官能基团，如（NH2NH2，APSAPS）和氰基团（）和氰基团（CNCN，CPSCPS）的键合相填料。适用于不溶于水）的键合相填料。适用于不溶于水/有机混有机混合物的亲脂类样品合物的亲脂类样品 使用的流动相（极性相对比固定相低，分离的使用的流动相（极性相对比固定相低，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。第14页，本讲稿共41页 液相色谱流程图液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理第15页，本讲稿共41页色谱柱基本性能参数硅胶纯度硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度尺寸尺寸 填料床的长度和内径填料床的长度和内径粒径粒径 平均颗粒直径，通常平均颗粒直径，通常3-103-10m m 孔径孔径 颗粒的孔或者腔的平均尺寸，范围颗粒的孔或者腔的平均尺寸，范围80-100A80-100A封尾封尾 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 第16页，本讲稿共41页色谱中常用的术语色谱图色谱图色谱图色谱图 组分从色谱柱流出并通过检测器时所组分从色谱柱流出并通过检测器时所产生的响应信号的微分曲线产生的响应信号的微分曲线第17页，本讲稿共41页基线基线基线基线 正常情况下，仅有流动相通过检测线时所产生的响应信号的曲线。正常情况下，仅有流动相通过检测线时所产生的响应信号的曲线。峰高（峰高（峰高（峰高（h h h h）峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离峰宽（峰宽（峰宽（峰宽（W W W W）峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰高一峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰高一半处的峰宽叫半高峰宽（半处的峰宽叫半高峰宽（W W h h）死时间（死时间（死时间（死时间（t0t0t0t0）实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间 保留时间（保留时间（保留时间（保留时间（tRtRtRtR）从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间的时间,称为此组分的保留时间称为此组分的保留时间 调整保留时间调整保留时间调整保留时间调整保留时间(tR)(tR)(tR)(tR)扣除死时间后的保留时间扣除死时间后的保留时间 tR=tR-t0tR=tR-t0tR=tR-t0tR=tR-t0 容量因子（容量因子（容量因子（容量因子（k k k k）k=tR k=tR k=tR k=tR t0 t0 t0 t0 k k值越大，组分出柱越慢，保留时间值越大，组分出柱越慢，保留时间越长越长第18页，本讲稿共41页第19页，本讲稿共41页柱效柱效柱效柱效 柱效简而言之就是色谱柱对色谱中物质分离能力的大小。柱效越高，柱效简而言之就是色谱柱对色谱中物质分离能力的大小。柱效越高，分离效果越好，峰形越好。色谱柱的柱效和填料、柱长、柱内径均有分离效果越好，峰形越好。色谱柱的柱效和填料、柱长、柱内径均有关系，一般来说，填料越细密、柱长径比越大，柱效越高。柱校的衡关系，一般来说，填料越细密、柱长径比越大，柱效越高。柱校的衡量用理论塔板数来表示。量用理论塔板数来表示。理论塔板数（理论塔板数（理论塔板数（理论塔板数（n n n n）n=5.54(tR/n=5.54(tR/n=5.54(tR/n=5.54(tR/W W W W h h h h)2 2 2 2 n=16(tR/W)n=16(tR/W)n=16(tR/W)n=16(tR/W)2 2 2 2理论塔板高度（理论塔板高度（理论塔板高度（理论塔板高度（H H H H）H=L/n L:H=L/n L:H=L/n L:H=L/n L:色谱柱长色谱柱长色谱柱长色谱柱长第20页，本讲稿共41页分离度（分离度（分离度（分离度（R)R=2R)R=2R)R=2R)R=2（tRtRtRtR2 2 2 2-tR-tR-tR-tR1 1 1 1）/（W W W W1 1 1 1+W+W+W+W2 2 2 2)相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰宽总和一半的比值。相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰宽总和一半的比值。R1R1R1R1时时时时,两峰有部分重叠两峰有部分重叠两峰有部分重叠两峰有部分重叠R=1R=1R=1R=1时时时时,分离程度可达分离程度可达分离程度可达分离程度可达98%98%98%98%R=1.5R=1.5R=1.5R=1.5时时时时,分离程度达分离程度达分离程度达分离程度达99.7%99.7%99.7%99.7%，可认为两组分完，可认为两组分完，可认为两组分完，可认为两组分完全分离全分离全分离全分离增加柱长可以提高分离度，但延长了分析时间增加柱长可以提高分离度，但延长了分析时间第21页，本讲稿共41页拖尾因子（拖尾因子（拖尾因子（拖尾因子（T T T T）T=WT=WT=WT=W0.050.050.050.05/2d/2d/2d/2d0.050.050.050.05W W0.050.05 W W0.050.05 5%5%峰高处峰宽峰高处峰宽 D D0.050.05 5%5%峰高处的前半峰宽峰高处的前半峰宽中国药典中国药典中国药典中国药典规定规定规定规定T T T T应为应为应为应为0.950.950.950.951.051.051.051.05。T0.95T0.95T0.95T1.05T1.05T1.05T1.05为拖尾峰。为拖尾峰。为拖尾峰。为拖尾峰。第22页，本讲稿共41页色谱图的峰位置用于定性，色谱峰的峰高和峰色谱图的峰位置用于定性，色谱峰的峰高和峰面积用于定量，峰位置和峰宽用于色谱柱分离面积用于定量，峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。性能的评价和色谱条件的优劣。第23页，本讲稿共41页流动相流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：纯度：采用纯度：采用纯度：采用纯度：采用“HPLCHPLC ”级溶剂级溶剂级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂剂剂剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配与检测器相匹配与检测器相匹配第24页，本讲稿共41页溶溶 剂剂 等等 级级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸吸吸光光光光率率率率第25页，本讲稿共41页HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1 1 专门的纯水机或超纯水机；专门的纯水机或超纯水机；2 2 去离子水重蒸；3 二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水；4 4 采用类似家用的纯水机；5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；6 6 其它途径；第26页，本讲稿共41页不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。第27页，本讲稿共41页溶剂前处理 过滤：过滤：过滤：过滤：0.45um0.45um0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。第28页，本讲稿共41页滤膜类型滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。第29页，本讲稿共41页溶剂前处理 脱气脱气脱气脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡泡泡泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：1 1 1 1）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小 2 2 2 2）基线波动）基线波动）基线波动）基线波动 返回第30页，本讲稿共41页等度洗脱等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器单单一或混合溶一或混合溶剂剂第31页，本讲稿共41页梯度洗脱梯度洗脱 A 泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器 B泵泵AB时间时间B 浓浓度度第32页，本讲稿共41页分析分析时间长时间长分离度差分离度差分离度差分离度差 MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS type)等度洗脱等度洗脱第33页，本讲稿共41页95%30%MeOH 浓浓度度梯度洗脱梯度洗脱第34页，本讲稿共41页混合器混合器低低压压梯度比例梯度比例阀阀 高高压压梯度梯度低低压压梯度梯度脱气机脱气机高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第35页，本讲稿共41页返回高高压梯度系梯度系统梯度准确度好梯度准确度好梯度准确度好梯度准确度好系系系系统统复复复复杂杂(需两台或三台需两台或三台需两台或三台需两台或三台泵泵)低低低低压压梯度系梯度系梯度系梯度系统统系系系系统简单统简单需在需在需在需在线线脱气机脱气机脱气机脱气机存在存在存在存在时间时间滞后效滞后效滞后效滞后效应应高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第36页，本讲稿共41页泵的保养使用流动相尽量要清洁；使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；品的交叉污染；第37页，本讲稿共41页色谱柱1 1）柱压低于）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）色谱柱）2 2）柱温在）柱温在4040左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为503 3）流动相）流动相PH使用范围为使用范围为2 27.57.5返回ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：第38页，本讲稿共41页柱的保养：柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；进样样品要提纯；严格控制进样量；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；第39页，本讲稿共41页LC检测器检测器 紫外可见检测器紫外可见检测器紫外可见检测器紫外可见检测器（UV/VISUV/VIS）二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器（PDAPDA）示差检测器示差检测器示差检测器示差检测器（RIDRID）电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器（CDDCDD）荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器（RFRF）电化学检测器电化学检测器电化学检测器电化学检测器（L-ECDL-ECD）质谱检测器质谱检测器质谱检测器质谱检测器（MSMS）蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（ELSDELSD）第40页，本讲稿共41页 第一部分到此结束第一部分到此结束第一部分到此结束第一部分到此结束 谢谢各位同学老师谢谢各位同学老师谢谢各位同学老师谢谢各位同学老师欢迎批评指正欢迎批评指正欢迎批评指正欢迎批评指正 第41页，本讲稿共41页