XXXX年本科实验四 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定.pptx

XXXX年本科年本科实验四四 重重组质粒粒DNA提提取、双取、双酶切切鉴定定基因克隆基因克隆v定义：定义：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。基因工程基因工程v定义：定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组作统称为基因工程，又称重组DNA技术。技术。v基因克隆示意图基因克隆示意图分、切分、切接接转转筛筛 基因载体基因载体基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)vector)主要包括主要包括质粒质粒质粒质粒(plasmid)plasmid)、噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(phage)phage)和和病毒病毒病毒病毒(virus)virus)柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。实验内容2.2.限制性内切酶的酶切鉴定限制性内切酶的酶切鉴定(P82)(P82)3.3.定性鉴定定性鉴定:DNA:DNA的琼脂糖凝胶电的琼脂糖凝胶电泳泳4.4.定量检测：定量检测：DNADNA的紫外分光光度法的紫外分光光度法测定测定(P39)(P39)1.1.质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化(P70(P70碱法碱法)实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用作用;掌握掌握核酸内切酶切割核酸内切酶切割质粒的原理并质粒的原理并学会运用内切学会运用内切酶酶一一.质粒质粒DNA的提取的提取1 1 关于质粒的概念关于质粒的概念a.a.什么是质粒（什么是质粒（plasmidplasmid）？）？b.b.质粒的本质是什么？质粒的本质是什么？c.c.质粒有哪些构型？质粒有哪些构型？c.c.质粒有哪些特点？质粒有哪些特点？d.d.质粒的用途有哪些？质粒的用途有哪些？81.1 1.1 质粒的定义质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链环状双链DNADNA分分子子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。9(1)(1)超螺旋超螺旋DNA(supercoiled DNA,SC DNA)1.2 1.2 质粒的三种构型质粒的三种构型10(2)(2)开环开环DNA(open circular DNA,OC DNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11(3)线状线状DNA(linear DNA,L DNA):如果两条链均断开，即为线状如果两条链均断开，即为线状DNADNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）12最快中最慢1.3 1.3 质粒质粒DNADNA的基本特征：的基本特征：(1)自主复制性自主复制性：能独立于染色体：能独立于染色体DNA外自主复制；外自主复制；(2)可扩增性可扩增性：严紧型复制：严紧型复制-复制复制1-5个拷贝个拷贝 松弛型复制松弛型复制-复制数十个拷贝；复制数十个拷贝；(3)可转移性可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞；移到另一个宿主细胞；(4)不相容性不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。141.4 1.4 理想的克隆载体：理想的克隆载体：(1)分子质量小、多拷贝、松弛控制型分子质量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制酶的单切点具有多种常用的限制酶的单切点；(3)能插入较大的外源能插入较大的外源DNA片段片段；(4)具有容易操作的检测表型具有容易操作的检测表型。15151.4 1.4 提取质粒提取质粒DNADNA的目的与意义：的目的与意义：基因载体基因载体/基因克隆基因克隆/基因工程基因工程2.1 2.1 提取质粒提取质粒DNADNA的常规方法的常规方法 (1)SDS (1)SDS碱裂解法碱裂解法 (2)(2)煮沸法煮沸法 (3)high pure plasmid isolation kit等。等。但原理相似，都是利用宿主但原理相似，都是利用宿主染色体染色体DNADNA和质粒和质粒DNADNA的差异的差异来分离的：来分离的：宿主菌染色体宿主菌染色体DNA通常比质粒通常比质粒DNA要大得多要大得多 纯化分离的宿主菌纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。呈闭合环的形式。2 2 提取大肠杆菌质粒提取大肠杆菌质粒DNADNA的的方法和原则方法和原则2.2 2.2 分离纯化质粒分离纯化质粒DNADNA的主要步骤的主要步骤(1)(1)培养细菌使质粒扩增（培养细菌使质粒扩增（DNADNA的扩增与选择）的扩增与选择）(2)(2)细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 v收集方法：高速离心的方法vv裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、碱变性法碱变性法碱变性法碱变性法、沸水沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择。(3)(3)质粒质粒DNADNA的纯化的纯化 v 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA相对较相对较 小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。2.3 2.3 核酸分离纯化的总原则：核酸分离纯化的总原则：v (1)(1)保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整v (2)(2)排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、糖、有机溶剂、金属离子、其他有机溶剂、金属离子、其他DNADNA、RNARNA等）等）3.SDS-3.SDS-碱裂解法提取碱裂解法提取Puc119-U6Puc119-U6重组质粒重组质粒DNADNA3.1 3.1 实验原理：实验原理：高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质3.2 3.2 主要试剂及作用主要试剂及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisHClCl组成组成.(保护、缓冲保护、缓冲)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的 机械机械 剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒.(保护作用保护作用)EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）质粒分子的降解作用。（保护作用）TrisHCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作范围（缓冲作用）用）21 溶溶液液IIII：由由SDSSDS（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠）与与 NaOH NaOH 组组成成(裂裂解解、变变性性)SDSSDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNADNA分子变性（分子变性（DNADNA变变性作用）性作用）22溶液溶液IIIIII：HAC(HAC(乙酸乙酸)和和 KAC(KAC(乙酸钾乙酸钾)组成的高盐溶液组成的高盐溶液 (复性，分离复性，分离)HACHAC溶液溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA DNA 变性而发生缠绕，并使质粒变性而发生缠绕，并使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。3.3 3.3 实实验验步步骤骤加加1.4ml1.4ml培养物于培养物于EPEP管，管，12000rpm1min12000rpm1min，去上清，去上清，再加再加1.4ml1.4ml培养物至原管，培养物至原管，12000rpm1min12000rpm1min，去上清，去上清加入冰的加入冰的200 l 200 l 溶液溶液I I，剧烈振荡剧烈振荡EPEP管，室温放置管，室温放置3min3min加入加入200l 200l 溶液溶液IIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min 3min（不要振荡！）（不要振荡！）加入加入150l 150l 冰冰溶液溶液IIIIII，温和振荡，温和振荡10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000rpm5min12000rpm5min转移上清转移上清500l500l到新到新EPEP管，加入等体积管，加入等体积500l500l的的酚与酚与氯仿氯仿/异戊醇的混合物（异戊醇的混合物（1:11:1混合）混合），充分颠倒混匀，充分颠倒混匀，4 12000rpm5min4 12000rpm5min400400ll上层水相转移到新的上层水相转移到新的EPEP管，管，加入等体积加入等体积400l400l氯仿氯仿/异戊醇异戊醇，颠倒混匀，颠倒混匀，4 4 12000rpm 12000rpm 5min5min400400ll上层水相转移到新的上层水相转移到新的EPEP管管，加入，加入2 2倍体积倍体积800l800l无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，-20 -20 冰箱中放置冰箱中放置15min15min，4 12000rpm4 12000rpm 10min10min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 1ml 70%70%乙醇乙醇，4 12000rpm5min 4 12000rpm5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置5-10min5-10min，20 l TE 20 l TE 溶解溶解DNADNA注意事项：注意事项：1、加样枪正确使用；2、标记自己所提取的质粒类型；3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要换枪头；5、离心前把管擦干；6、转移上清时不要吸到沉淀；7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤；8、每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余DNA储存于-20用于电泳对 照！二、限制性内切酶切割重组质粒二、限制性内切酶切割重组质粒 1 1 关于限制性核酸内切酶关于限制性核酸内切酶 （restriction endonucleaserestriction endonuclease）1.1 1.1 定义定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNADNA分子分子的断裂的断裂,产生相应的限制性产生相应的限制性DNADNA片段。片段。主要存在于细菌体内。主要存在于细菌体内。切割不同来源的切割不同来源的DNADNA分子将产生特征性限制性酶分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀分子手术刀”）。）。261.3 1.3 作用作用 与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。1.2 1.2 分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。1.4 1.4 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶2 BamHI 2 BamHI、HindHind酶切质粒及鉴定酶切质粒及鉴定2.1 2.1 实验原理：实验原理：利用限制性内切酶特异的识别利用限制性内切酶特异的识别DNADNA特异的特异的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,产生一定长度的产生一定长度的DNADNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒别目的基因（重组质粒DNADNA）29重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind IIIPUC119（3.2Kb）U6启动子（256bp）2.2 2.2 实验材料实验材料:(1)(1)重组质粒重组质粒;(2)(2)BamHIBamHI 、HinHind d 限制性内切酶限制性内切酶;(3)(3)反应缓冲液。反应缓冲液。322.3 2.3 实验步骤实验步骤(1)(1)建立反应体系建立反应体系(2)(2)酶切反应（温育酶切反应（温育12h12h）(3)(3)电泳鉴定（下次实验课内容）电泳鉴定（下次实验课内容）332.4 2.4 双酶切体系双酶切体系 质粒质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 34合计合计 20l 准备室准备室老师已老师已加好加好同学自己加同学自己加37，12h（0.2mlEP管，管，PCR仪）仪）注：余下注：余下10ulDNA保存于保存于-20冰箱冰箱