lipo2000转染操作步骤.pdf
Lipo2000Lipo2000 瞬时转染细胞步骤瞬时转染细胞步骤StealthStealth RNAi or siRNA TransfectionRNAi or siRNA Transfection以 24 孔板为例，其余规格的转染见表 11 中板,细胞密度为30-5030-50适宜适宜。注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。2 第二天(2436 小时后）每个孔转染方式如下：A 将 20pmol siRNA 溶于 50ul Opti-mem 无血清培养基中.B 将 1ul lipo2000 溶于 50ul Optimem 无血清培养基中,混匀室温放置 5min。C 将 A B 两管混合，放置 20min。3 转染期间,将 24 孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C 管 mix 加入24 孔板对应孔中，4-6 小时候换成有血清培养基.Plasmid DNA TransfectionPlasmid DNA TransfectionDNA（ug）:lipo 2000(ul）=1：23转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性.1 中板。贴壁细胞：0。5-2X105cells/well,第二天待细胞密度达到707080%80%时转染悬浮细胞：48X105cells/well,中板后随即转染。2 转染.A 将 0。8ug DNA 溶于 50ul Optimem 无血清培养基中.B 将 2ul lipo2000溶于 50ul Optimem 无血清培养基中，混匀室温放置 5min。C 将 A B 两管混合，放置 20min。转染期间，将 24 孔板培养基换成无血清培养基，每孔 400ul。将 C 管 mix 加入24 孔板对应孔中,4-6 小时候换成有血清培养基。Table 1.Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection中板密度CultureSurf.vesselVol.ofVol.ofdilutionmedium2X25ul0。2ugDNALipofectamine20000.5ul5pmolRNALipofectamine20000.25ularea perplatingwellmedium100ul10001000096cell/wellwell0。3cm20。5-2X10524-well2cm2cell/well13X10512-well4cm2cell/well23X1056well10cm2cell/well8-10X105cell/dish23X10610cmcell/dish60cm2（35mm)60mm20cm2500ul2X50ul0.8ug2。0ul20pmol1。0ul1ml2X100ul1.6ug4.0ul40pmol2。0ul2ml2X250ul4。0ug*10ul100pmol5ul4ml2X0。5ml8.0ug20ul*200pmol10ul15ml2X1。5ml24ug60ul600pmol30ul*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考*:6 孔板细胞质粒转染量 1-2ug 足以。*：6cm dish 细胞质粒转染量 46ug 足以.OptiMEM I 减血清培养基是 EMEM 的改良型，其中使用了 HEPES 和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和 lip2000 分别混合.常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶(CAT）,绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux 或 Luc）细胞中本身不表达以及 b 半乳糖苷酶（b-gal）在细胞中有内源表达,需设计空白对照。当报告基因与目的基因共转时，作为内参，评估目的基因的转染效率，并作为分选标志.像 293T 细胞，因为半贴壁，换液容易导致细胞飘起来，所以中间不换液.转染步骤及经验（精华转染步骤及经验（精华)一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。三、转染注意事项1.血清A.DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。B一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.C。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基 OPTI-MEM培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTIMEM(GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替 PBS 洗细胞两遍，注意洗的时候要轻,靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多.2。抗生素(PS）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞的活性,导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是 GENETICIN 选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。3。细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做.有文献说传代不要超过17代.细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好,不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化.大多数已建立的细胞系都是非整倍体,原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。因此,如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。或者,几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。4.细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。因转染试剂对细胞有毒害作用,细胞太少，容易死。一般转染时，贴壁细胞密度为 7090%，悬浮细胞密度为 2-4106 细胞/ml，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要.铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量.5。DNA 量高质量的 DNA 对于进行高效的转染至关重要。转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于 0。35ug/ul。产物表达：48 小时 mRNA 表达最高；72h 蛋白表达最高。6.瞬时和稳定表达及监测基因的瞬时表达在 2472 小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。下一步也可以做RT-PCR 和 Western blot进行验证.可以使用报告基因来确定优化条件,其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT)，绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux 或 Luc)以及 b 半乳糖苷酶（b-gal)，
