包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程.pdf

包包涵涵体体蛋蛋白白包包被被 E EL LI IS SA A板板检检测测抗抗体体的的流流程程 Hessen was revised in January 2021包涵体蛋白包被 ELISA板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被 ELISA 板。（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。（2）按照常规流程溶解使用 8M 尿素或者 1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。剧烈震动后，室温静置 30 分钟至 2 小时或者 4过夜，使其缓慢溶解。注：每 100mL 细菌提取的包涵体使用 2mL 含 8M 尿素的 Buffer A 溶解；或者每 100mL 细菌提取的包涵体使用 2mL 含 1%SKL 的 Buffer A 溶解（使用前混合，ml Buffer A 加入 ml 20的 SKL 贮存液）。（3）抗原稀释：使用 碳酸盐包被缓冲液（CBS）4 倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20冰箱，减少冻融次数。注意必须由少到多逐渐加入 CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。DMSO 溶解的用 CBS 稀释 4 倍。加入 1:2-5 倍 PBS/TE/SW 液体后切胶磨碎，4 度放置 3-7 天，最高转速 4 度离心取上清冻存。二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4融化。在 ELISA 板每孔加入 100L CBS。将 100L 抗原加入ELISA 板第一竖排孔中；吹打 4-5 次后，吸出 100L 加到第二竖排孔中；吹打 4-5 次后，吸出100L 加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的 100L 液体弃去。注：每种抗原至少稀释 3 行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含 8M 尿素的 Buffer A做对照。2、包被：4过夜或 37温育 2 小时。弃去孔内溶液，用 PBST 洗 3 次（洗涤方法：在 ELISA 孔中加满PBST，室温静置 5 分钟后弃去，反复三次）。拍干！3、封闭：5%脱脂乳 300L，37温育 2 小时或 4过夜。弃去孔内溶液，用 PBST 洗 3 次，拍干！。封闭不彻底会导致假阳性！4、稀释阳性血清：在本实验中，傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做 1000 倍稀释。5、加样：将 100L 稀释好的血清加入上述已包被之反应孔中，置 37孵育 1-2 小时。用 PBST 洗 3次，拍干！。6、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗 100L。37孵育不超过 1 小时，PBST 洗涤3 次，拍干！。7、加底物液显色：各反应孔中加入 100L TMB（避光），37 10-30min 显色。注：商品化的 TMB 其实是 TMB 和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过 1 个月都会导致试剂失效。8、终止反应：于各反应孔中加入 50L2M 浓硫酸。9、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“”、“”号表示。也可测定 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的倍，即为阳性。10、结果分析：观察阴性对照是否也发生反应；选择检测阳性的最高稀释倍数前 3-4 孔的稀释度作为最佳包被浓度。例如，阳性血清如果前 8 孔为阳性，那么以后检测时抗原可以做 2稀释后包板为宜。三、包涵体包被 ELISA 板检测未知抗体：4-51、稀释抗原：按照前期实验结果，用 CBS 稀释抗原。每孔加入 100L 抗原稀释液。2、包被：4过夜或 37温育 2 小时。弃去孔内溶液，用 PBST 洗 3 次（洗涤方法：在 ELISA 孔中加满PBST，室温静置 5 分钟后弃去，反复三次）。拍干！3、封闭：加入 300L 5%脱脂乳，37温育 2 小时或 4过夜。弃去孔内溶液，用 PBST 洗 3 次。拍干！封闭不彻底会导致假阳性！4、加样：将 25-100L 细胞上清或者待检血清加入上述包被孔中，置 37孵育 1-2 小时或 4过夜。用 PBST 洗 3 次，拍干。（根据实验设计，同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）5、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗 100L。37孵育不超过 1 小时，PBST 洗涤3 次。拍干！6、加底物液显色：各反应孔中加入 100L TMB（避光），37 10-30min 显色。注：商品化的 TMB 其实是 TMB 和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过 1 个月都会导致试剂失效。7、终止反应：于各反应孔中加入 50L 2M 浓硫酸。8、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“”、“”号表示。也可测定 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的倍，即为阳性。计算公式：（待测样 OD空白 OD）/（阴性对照 OD空白 OD）。大于可判读为阳性。试剂与耗材（1）SDS 裂解液 200mL成分SDSTris pHEDTA终浓度%10mM1mM用量100mM 2mL（2）包被缓冲液（pH M CBS 碳酸盐缓冲液）：（3）洗涤缓冲液（pH，M PBS）：（4）封闭液：（5）终止液（2 M H2SO4）：