第七章基因诊断与基因治疗课件.ppt

第七章第七章基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗第第 一一 节节 基基 因因 诊诊 断断Genetic DiagnosisGenetic Diagnosis基因诊断基因诊断基因基因蛋白质蛋白质性状性状生化生化诊断诊断基因基因诊断诊断临床临床诊断诊断 特点特点针对性强针对性强 特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高 适应性强适应性强一、基因诊断特点一、基因诊断特点定义定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。正常，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断过程：基因诊断过程：关键要素：关键要素：探针探针DNADNA、目、目的的DNADNA、信号、信号检测检测基因诊断过程：基因诊断过程：1.制备基因探针制备基因探针2.提取目的基因，获得单链提取目的基因，获得单链DNA3.PCR扩增扩增DNA4.目的目的DNA与尼龙膜结合与尼龙膜结合5.探针与目的探针与目的DNA互补配对互补配对6.冲洗尼龙膜冲洗尼龙膜7.检测杂合分子检测杂合分子三.三.基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法n核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术n限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法(restriction fragment length(restriction fragment length polymorphism,polymorphism,RLFPRLFP)n等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific(allele specific oligonucleotideoligonucleotide,ASO)ASO)n聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术nSSCPSSCP（PCR-SSCPPCR-SSCP）n生物芯片生物芯片n基因测序基因测序RLFP分析法分析法 举例举例：镰刀状红细胞贫血镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子珠蛋白基因的第六个密码子A ATT 表达产物：表达产物：谷谷氨酸氨酸缬缬氨酸氨酸 一个碱基突变一个碱基突变缺失缺失1个个MstMst内切酶内切酶位点位点 正常人：正常人：1.1kb1.1kb 患者：患者：1.3kb1.3kbMst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析甲型血友病的基因诊断（连锁分析甲型血友病的基因诊断（连锁分析1 1）53引物引物1引物引物299 bp43 bpBcl I因子因子VIII 基因基因142 bp 片段片段甲型血友病的基因诊断（连锁分析甲型血友病的基因诊断（连锁分析2 2）142 bp99 bp43 bp异常带异常带先证者先证者胎儿胎儿点点突变（突变（C to T）5335G53引物引物1引物引物2探针探针1探针探针2A等位基因特异寡核苷酸探针（等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）PCR/单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。定致病基因的存在。正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 病病患者患者 PCR/SSCP分析分析+DNA链末端合成终止法链末端合成终止法基因测序基因测序（四）（四）基因芯片基因芯片n 阅读课本，思考：阅读课本，思考：n基因芯片与基因诊断有什么关系基因芯片与基因诊断有什么关系？n 基因芯片有什么优点？基因芯片有什么优点？n 基因芯片有哪些应用？基因芯片有哪些应用？基因芯片技术基因芯片技术三、基因诊断的应用三、基因诊断的应用n遗传疾病遗传疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病，传染性流行病感染性疾病，传染性流行病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定肿瘤基因诊断的策略肿瘤基因诊断的策略1.检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因2.检测肿瘤相关病毒的基因检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌鼻咽癌EB，宫颈癌宫颈癌HPV3.检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）结肠癌结肠癌癌胚抗原癌胚抗原（CEA）肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测ras癌基因的检测癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第12，13或或61密码子突变密码子突变检测方法：检测方法：1.PCR/ASO2.PCR-SSCP p53的检测的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子于密码子130290检测方法：检测方法：1.PCRSSCP2.PCR测序测序3.PCRRFLP第第 二二 节节 基基 因因 治治 疗疗Gene TherapyGene Therapy基基基基因因因因修修修修正正正正(gene gene correction)correction)：定定定定点点点点导导导导入入入入外外外外源源源源正正正正常常常常基基基基因因因因，代代代代替替替替有有有有缺缺缺缺陷陷陷陷的的的的基基基基因因因因，对对对对靶靶靶靶细细细细胞胞胞胞基基基基因因因因组组组组无无无无任任任任何何何何改改改改变变变变。属属属属于于于于直直直直接接接接治治治治疗疗疗疗。(外外外外源源源源基基基基因因因因干干干干扰扰扰扰、抑抑抑抑制制制制有有有有害害害害基基基基因因因因的的的的表达表达表达表达)基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗(gene gene therapy)therapy)：运运运运用用用用DNADNA重重重重组组组组技技技技术术术术设设设设法法法法修修修修复复复复患患患患者者者者细细细细胞胞胞胞中中中中有有有有缺缺缺缺陷陷陷陷的的的的基基基基因因因因，使使使使细细细细胞胞胞胞恢恢恢恢复正常功能复正常功能复正常功能复正常功能而达到治疗遗传病的目的。而达到治疗遗传病的目的。而达到治疗遗传病的目的。而达到治疗遗传病的目的。基基基基因因因因添添添添加加加加(gene gene augmentation)augmentation)：非非非非定定定定点点点点导导导导入入入入外外外外源源源源正正正正常常常常基基基基因因因因，而而而而没没没没有有有有去去去去除除除除或或或或修修修修复复复复有有有有缺缺缺缺陷陷陷陷的的的的基基基基因因因因。属属属属于于于于间间间间接治疗。接治疗。接治疗。接治疗。如腺苷脱氨酶（如腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症、膀胱纤维症和家族性血胆脂醇过多症（血清胆固醇高）；）缺乏症、膀胱纤维症和家族性血胆脂醇过多症（血清胆固醇高）；血友病等遗传病；恶性黑素瘤、神经细胞瘤、白血病、肾癌、卵巢癌和脑癌等癌症；以及血友病等遗传病；恶性黑素瘤、神经细胞瘤、白血病、肾癌、卵巢癌和脑癌等癌症；以及肝功能衰竭和艾滋病等。肝功能衰竭和艾滋病等。几种常见的基因失活技术几种常见的基因失活技术反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术三链技术三链技术干扰干扰RNA技术技术基因治疗的其他方法：基因治疗的其他方法：如如“自杀基因自杀基因”的应用，基因疫苗等的应用，基因疫苗等靶细胞（基因治疗的对象）：靶细胞（基因治疗的对象）：体细胞体细胞&性细胞性细胞 （美国政府（美国政府19851985年规定，目前治年规定，目前治疗仅限于体细胞）疗仅限于体细胞）体体体体细细细细胞胞胞胞基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗：使使使使患患患患者者者者症症症症状状状状消消消消失失失失或或或或得得得得到到到到缓缓缓缓解解解解，但但但但有有有有害基因仍能传给后代。害基因仍能传给后代。害基因仍能传给后代。害基因仍能传给后代。生生生生殖殖殖殖细细细细胞胞胞胞基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗：可可可可根根根根治治治治遗遗遗遗传传传传病病病病，使使使使有有有有害害害害基基基基因因因因不不不不再再再再在人群中散布。在人群中散布。在人群中散布。在人群中散布。已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制条件：条件：疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚 导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达 具有安全有效的转运载体和方法具有安全有效的转运载体和方法具有安全有效的转运载体和方法具有安全有效的转运载体和方法基因治疗的关键基因治疗的关键/条件条件关键：关键：外源基因的安全导入；外源基因的安全导入；外源基因的安全导入；外源基因的安全导入；外源基因高效正确的表达。外源基因高效正确的表达。外源基因高效正确的表达。外源基因高效正确的表达。基因治疗的步骤：基因治疗的步骤：1正常基因的制备：正常基因的制备：即分离、提取外源基因（目的基因）即分离、提取外源基因（目的基因）2 2、靶细胞的选择、靶细胞的选择3 3、外源基因（目的基因）的转移、外源基因（目的基因）的转移4 4、表达的检测、表达的检测5 5、回收到患者体内。、回收到患者体内。1.1.物理方法物理方法物理方法物理方法目的基因的转移目的基因的转移目的基因的转移目的基因的转移基因治疗的步骤基因治疗的步骤 直接注射法直接注射法直接注射法直接注射法1.1.物理方法物理方法物理方法物理方法（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移 直接注射法直接注射法直接注射法直接注射法 电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法 微粒子轰击法微粒子轰击法微粒子轰击法微粒子轰击法1.1.物理方法物理方法物理方法物理方法（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移2.2.化学法化学法化学法化学法：3.3.膜融合法膜融合法膜融合法膜融合法1.1.物理方法物理方法物理方法物理方法（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移2.2.化学法化学法化学法化学法3.3.膜融合法膜融合法膜融合法膜融合法4.4.受体载体转移法受体载体转移法受体载体转移法受体载体转移法:重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒+特异性多肽特异性多肽特异性多肽特异性多肽内吞内吞内吞内吞5.5.同源重组法同源重组法同源重组法同源重组法(homologous recombination)homologous recombination)Xba I Bst Ineo13.1 Kb Xba IXba IBst I11.1 Kb neo Xba I Bst I Xba I Bst I Xba I16.5 Kb7.7 KbBst I同源重组法同源重组法将将将将外外外外源源源源性性性性目目目目的的的的基基基基因因因因定定定定位位位位导导导导入入入入受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞的的的的染染染染色色色色体体体体上上上上，通通通通过过过过与与与与该该该该座座座座位位位位的的的的同同同同源源源源序序序序列列列列重重重重组组组组交交交交换换换换，使使使使外外外外源源源源DNADNA取取取取代代代代原位点上有缺陷的基因，达到原位点上有缺陷的基因，达到原位点上有缺陷的基因，达到原位点上有缺陷的基因，达到基因修正基因修正基因修正基因修正的目的。的目的。的目的。的目的。1.1.物理方法物理方法物理方法物理方法（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移（一）、目的基因的转移第四节第四节 基因治疗基因治疗2.2.化学法化学法化学法化学法3.3.膜融合法膜融合法膜融合法膜融合法4.4.受体载体转移法受体载体转移法受体载体转移法受体载体转移法5.5.同源重组法同源重组法同源重组法同源重组法(homologous recombination)homologous recombination)6.6.病毒介导转移法病毒介导转移法病毒介导转移法病毒介导转移法病毒介导转移法病毒介导转移法病毒介导基因转移病毒介导基因转移病毒介导基因转移病毒介导基因转移(virus mediated gene transfer)virus mediated gene transfer)以以以以病病病病毒毒毒毒为为为为载载载载体体体体，将将将将外外外外源源源源性性性性目目目目的的的的基基基基因因因因通通通通过过过过基基基基因因因因重重重重组组组组技技技技术术术术，组组组组装装装装到到到到病病病病毒毒毒毒载载载载体体体体上上上上，并并并并使使使使重重重重组组组组病病病病毒毒毒毒感感感感染染染染受受受受体体体体宿宿宿宿主细胞，完成基因转移。主细胞，完成基因转移。主细胞，完成基因转移。主细胞，完成基因转移。反转录病毒载体：反转录病毒虽是反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录病毒，但有反转录酶，可使酶，可使RNA转录为转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。再整合到宿主细胞基因组。小鼠小鼠小鼠小鼠白血病病毒白血病病毒白血病病毒白血病病毒 DNA病毒介导载体病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、病毒包括腺病毒、SV40、牛乳牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等。头瘤病毒、疱疹病毒等。近几年临床的基因治疗实例：近几年临床的基因治疗实例：复合免疫缺陷综合征的基因治疗复合免疫缺陷综合征的基因治疗黑色素瘤的基因治疗黑色素瘤的基因治疗血友病血友病 其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。中常见的囊性纤维化的进展很快。腺腺腺腺苷苷苷苷酸酸酸酸脱脱脱脱氨氨氨氨酶酶酶酶(ADA)ADA)缺缺缺缺乏乏乏乏症症症症是是是是ARAR致致致致死死死死性性性性疾疾疾疾病病病病，患患患患者者者者由由由由于于于于ADAADA缺缺缺缺乏乏乏乏，脱脱脱脱氨氨氨氨腺腺腺腺苷苷苷苷酸酸酸酸增增增增多多多多，改改改改变变变变甲甲甲甲基基基基化化化化能能能能力力力力，产产产产生生生生毒毒毒毒性性性性效效效效应应应应，使使使使T T淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞受受受受损损损损，导导导导致致致致严严严严重重重重的的的的联联联联合合合合免疫缺陷症，引起反复感染，以致死亡。免疫缺陷症，引起反复感染，以致死亡。免疫缺陷症，引起反复感染，以致死亡。免疫缺陷症，引起反复感染，以致死亡。1.1.ADAADA缺乏症缺乏症缺乏症缺乏症基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用1990年，年，Anderson小组小组 1%-25%(A)nLTRLTRADAneoSV1.ADA缺乏症缺乏症基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用患者的缺患者的缺陷基因是陷基因是否被被切否被被切除？除？1991年年复复旦旦大大学学首首次次进进行行乙乙型型血血友友病病的的基基因因治治疗疗，利利用用逆逆转转录录病病毒毒转转移移因因子子的的cDNA到到体体外外培培养的患者皮肤成纤维细胞中，再回植入患者皮下。养的患者皮肤成纤维细胞中，再回植入患者皮下。患患者者体体内内可可检检测测因因子子的的基基因因表表达达产产物物，浓浓度度约为正常人的约为正常人的 5。2、乙型血友病、乙型血友病3、癌症的治疗、癌症的治疗n 抑制癌细胞增生基因抑制癌细胞增生基因 导入癌细胞导入癌细胞n 抑制癌细胞转录抑制癌细胞转录 DNA片断导入癌细胞片断导入癌细胞n 提高机体免疫力基因导入提高机体免疫力基因导入免疫系统免疫系统阻断癌细阻断癌细胞繁殖胞繁殖提高免提高免疫力疫力例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗IL-2 Gene TNF-Gene（白介白介2）（肿瘤坏死因子）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体逆转录病毒载体 导入导入 TIL（体外培养的自体细胞）体外培养的自体细胞）回植患者体内回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞胞 的作用。的作用。如如：自杀基因自杀基因 +病毒载体病毒载体 转染转染 重组载体重组载体 药物前体药物前体 无毒无毒Gene酶酶 药物复合物药物复合物 有毒有毒 细胞死亡细胞死亡例如：例如：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制抑制DNA合成合成 脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）基因治疗的应用与展望基因治疗的应用与展望应用应用展望展望遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响减少外源基因对机体的不利影响 基因治疗有待解决的问题基因治疗有待解决的问题 1 1、难以获得真正有治疗作用的基因。难以获得真正有治疗作用的基因。2 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。、外源基因的表达难以在体内精确调控。3 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。改变。4 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5 5、随机整合潜在的威胁。、随机整合潜在的威胁。1999年年9月月，Arizona的的Jesse Gelsinger因因患患鸟鸟氨氨酸酸氨氨甲甲酰酰基基转转移移酶酶(OTC)部部分分缺缺乏乏症症在在Pennsylvania大大学学接接受受基基因因治治疗疗，4天天后后出出现现发发热热、凝凝血血而而死死亡亡，成为死于基因治疗实验的第一个病人。成为死于基因治疗实验的第一个病人。1.导入基因的持续表达导入基因的持续表达基因治疗中存在的问题及解决方法基因治疗中存在的问题及解决方法2.导入基因的高效表达导入基因的高效表达3.安全性问题安全性问题-2002年法国年法国基因治疗存在问题与伦理学基因治疗存在问题与伦理学 1导入基因的导入基因的稳定稳定/高效表达高效表达外源基因转移入病人体外源基因转移入病人体内细胞表达。内细胞表达。2导入基因的安全性基因治疗的导入基因的安全性基因治疗的安全性安全性应确保。不应确保。不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异。因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异。3试图纠正生殖细胞试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域(伦理）伦理）1999年年9月月，Arizona的的Jesse Gelsinger因因患患鸟鸟氨氨酸酸氨氨甲甲酰酰基基转转移移酶酶(OTC)部部分分缺缺乏乏症症在在Pennsylvania大大学学接接受受基基因因治治疗疗，4天天后出现发热、凝血而死亡，成为死于基因治疗实验的第一个病人。后出现发热、凝血而死亡，成为死于基因治疗实验的第一个病人。基因诊断与基因治疗（课堂练习）基因诊断与基因治疗（课堂练习）1 1.核酸分子杂交主要内容有核酸分子杂交主要内容有A.A.制备核酸样本制备核酸样本 B.B.制备与标记特异探针制备与标记特异探针B.B.C.C.核酸样本的分离、变性、转移和固定核酸样本的分离、变性、转移和固定D.D.预杂交、杂交和漂洗预杂交、杂交和漂洗 E.E.检测杂交信号检测杂交信号2.2.下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是A.A.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异RNARNA序列片断序列片断 B.B.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异DNADNA序列片断序列片断C.C.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测DNADNA或或RNARNAD.D.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测RNARNAE.E.原位杂交法可用于检测组织细胞中的原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNADNA或或RNARNA3.3.以下是关于以下是关于PCRPCR技术的叙述，错误是技术的叙述，错误是A.A.PCRPCR技术进行体外技术进行体外DNADNA扩增，其过程不同于体内扩增，其过程不同于体内DNADNA复制过程复制过程B.B.需要目的需要目的DNADNA两条链为模板两条链为模板C.C.需需TaqTaq 酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶D.D.需需RNARNA引物代替引物代替DNADNA引物引物E.E.PCRPCR需要需要DNADNA变性、复性和延伸变性、复性和延伸3 3个步骤的反复循环个步骤的反复循环4.4.基因诊断常用技术有基因诊断常用技术有A.A.核酸分子杂交核酸分子杂交 B.B.聚合酶链反应聚合酶链反应C.C.基因芯片基因芯片 D.D.基因测序基因测序D.D.E.E.以上都可以以上都可以