家畜猪牛羊戊型肝炎病毒检测巢式反转录聚合酶链反应法地方标准编制说明.docx

家畜猪牛羊戊型肝炎病毒检测巢式反转录聚合酶链反响法地方标准编制说明一、工程目的意义、工程来源、工作概况1、目的意义采取肝脏样品约1.02.0g,置于灭菌研钵中，充分研磨成匀 浆，加入灭菌的1 mol/L PBS，反复冻融3次。8 000 r/min 离心5 min,收集上清液，供RNA抽提或者-20。保存备用。2. 2粪便样品的采集及预处理挑取0.51.0g粪便样品于1.5ml离心管内，加入灭菌的1 mol/L PBS溶液,旋涡震荡混匀,制备成10%的粪便悬液,4, 8 000 r/min离心lOmin,收集上清液,供RNA抽提或者-20 保存备用。2.3待检样品RNA抽提取上述处理好的样品300叱于1. 5 mL离心管中，每管加入 ImLTrizol试剂,涡旋震荡充分混匀,室温放置5 min, 4 12000 r/min离心10 min；将上清移入一个新的EP管中， 加入250叱氯仿，盖紧盖子，用手剧烈震荡15s,置室温 2-3min后，412000 r/min离心10 min；将上层水相移入 一个新的EP管中，加入500叱异丙醇，翻转几次使液体混 匀，置室温lOmin,随后于4 12000 r/min离心10 min；弃 上清，加入1mL 75%乙醇,充分震荡混匀后于4 12000 r/min 离心5 min；小心弃去上清，放于通风处室温干燥10-15min, 加入30加0. 1% DEPC水溶解沉淀，并于55-60孵育10min, 获得的RNA样品可直接进行反转录或置-20保存备用。巢式RT-PCR检测3.1 RNA样品反转录(RT)在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各 成分：5XRT缓冲液(RT Buffer)： 2.0叱，终浓度为1倍；M-MuLV反转录酶：0.2 ML,终浓度为4 U/叱；RNA酶抑制剂：0.2应，终浓度为0.8 U/叱；10 mmol / L dNTPs 混合物：0. 8 叱，终浓度为 0. 8 mmol / L；25 Hmol/L HEV外套下游引物(HEV-E2)： 0.4配，终浓度 为 1. OMmol / Lo待检样品RNA： 6. 4 ML；反响总体积为10叱。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反 应管置于PCR仪内，按如下程序进行RT反响：42 lh； 然后95 5min°RT反响获得的cDNA可直接进行PCR反 应或置-20保存备用。本加样操作应在一个无RNA酶 (RNase)的条件下进行。3. 2 nested PCR 检测3. 2. 1外套PCR反响（第1次PCR反响）在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各 成分：10XBuffer： 2.5瓦，终浓度为1倍；20 mmol/L MgCl2： 2. 0 2L,终浓度为 1. 6 mmol/L；10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 叱，终浓度为 0. 2 mmol/L；5 u/叱 4qDNA聚合酶：0.3叱，终浓度为0. 06 u/nL；25 Mmol/LHEV 外套上下游引物（HEV-El/HEV-E2）：各 0. 5 2L, 终浓度为0. 5 mol/L；RT反响产物（cDNA）： 3肛；灭菌双蒸水：补足至总体积为25 ptLo加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按 如下反响程序进行PCR反响：94 4 min；然后进入94 40 s, 54 40 s, 72 60 s的循环，共进行35个循环； 72 10 min； 4 结束扩增。PCR产物用于下一轮内套PCR 反响。3. 2. 2内套PCR反响（第2次PCR反响）在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各 成分：10XBuffer： 2.5 HL,终浓度为 1 倍；20 mmol/L MgCl2： 2.0 叱，终浓度为 1. 6 mmol/L；10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 瓦，终浓度为 0. 2 mmol/L；5 u/ML Taq DNA聚合酶：0. 3乩，终浓度为0. 06 u/叱；25 Mmol/L HEV 内套上下游引物（HEV-E3/HEV-E4）：各 0. 5 HL, 终浓度为0. 5 Mmol/L；第一次PCR产物：3 NL；灭菌双蒸水：补足至总体积为25瓦。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按 如下反响程序进行PCR反响：94 4 min；然后进入94 35 s, 56 40 s, 72 50 s的循环，共进行35个循环;72 10 min； 4 结束扩增。PCR产物可直接进行琼脂 糖凝胶电泳分析或置4 保存备用。阴性及阳性对照：阴性对照，用3 NL DEPC H20代 替模板RNA作阴性对照。阳性对照，用HEV参考株NNA-1株 按上述操作方法获得的cDNA样品3叱作为阳性对照模板。3.3特异性试验分别对PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV等相关病毒病原，提 取核酸PCR扩增，检验方法的特异性。3. 4敏感性试验将培养并滴定含量的HEV做10倍系列稀释，提取病毒RNA, 以此为模板进行套式RT-PCR,根据其能检测的最大稀释度判 定套式RT-PCR最小检出量。3.5田间样品检测对2009年起对广西兽医研究所收集、保存的1200多份疑似 HE病例猪、牛、羊的粪便、肝脏以及局部市售与屠宰场猪、 牛、羊的肝脏进行检测。4、试验结果:以HEV参考株为模板,建立了检测家畜HEV的巢式RT-PCR方 法。应用该方法对HEV参考株RNA进行扩增,获得与预期大 小相符,长度为328bp的目的片段。而阴性对照、空白对照、 PRRSV、CSFV以及PPV、PRV、JEV扩增产物均无328bp特异 性条带出现。检出HEV-RNA的灵敏度约为9pg o说明该方 法对HEV的检测特异性强、敏感性高。在采集的H77份HE疑似病料样品中,采用该方法检测有334 份为HEV阳性。该方法可满足对猪、牛、羊的粪便、肝脏样 品中HEV检测的需要。四、与现行法律、法规和有关标准的关系HE是我国医学乙类法定传染病，一种新出现的严重危害人类 健康的重要人畜共患传染病。从事HEV的检测实验，必须遵 守动物疫病实验室检验采样方法（NY/T541-2002）、病 原微生物实验室生物安全管理条例（中华人民共和国国务 院令第424号）、兽医实验室生物安全管理规范（农业部 302号公告）等相关法律、法规和强制性标准。对于家畜HE 的检测和诊断，目前尚无国家标准及相关行业及地方标准。 PCR方法快速、准确、敏感、操作较简便，易标准化，能准 确快速检测和诊断猪HEO目前多数基层单位均装备有PCR仪 及相关设备，而且HEV的PCR检测操作可在一般兽医实验室 如BSL-2实验室甚至BSL-1实验室中进行，所以易于在基层 推广应用。综上所述，本标准提供的巢式RT-PCR检测方法 不仅与目前现行法律、法规和有关标准没有冲突，而且是对 现行行业标准和防治技术规范的有益补充。五、采用国际标准或国外先进标准的情况 本标准为国内首创，未采用国际标准或国外先进标准。六、主要反响意见的处理情况已对专家反响意见进行归纳、整理，并按要求对标准征求意 见稿进行补充、修改、完善。七、地方标准作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议 本项标准的制订，试验数据充分、可靠，经过实验室和临床 实践的考验，可作为广西推荐性地方标准，适用于猪、牛、 羊等家畜HEV感染的检测。八、贯彻标准的措施和建议1、加大对兽医基层单位的宣贯和技术培训力度；2、加大投入，争取推出商品化的，且经过标准化的诊断试 剂盒，便于基层单位使用；3、争取升级为国家标准或行业标准。九、其他应予说明的事项暂无。戊型肝炎(Hepatitis E , HE),简称戊肝，是由戊型 肝炎病毒(HEV)引起的主要通过消化道传播的人畜共患的 急性传染病。HEV宿主广泛，除人之外，与人密切相关的猪、 牛、羊、犬、马、鸡、鼠等多种动物均可感染。人发病以青 壮年为主，尤其孕妇易感性较高。病人表现发热、全身疲乏、 食欲不振、恶心、呕吐、尿黄、眼和皮肤发黄，肝区痛，肝 肿大。孕妇感染病情重且病死率高，易发肝功能衰竭，导致 流产、死胎，妊娠晚期病死率高达10-39%,可谓“孕妇杀手”。 在临床病例中HE占成年人急性病毒性肝炎的52%,病死率达 2. 5%,远高于甲肝的0. 12%0流行病学调查说明我国猪群的 HEV的感染率很高。家畜感染HEV后一般不表现临床病症， 通常因缺乏临床表现而被忽视，但家畜是与人生活接触较密 切的HEV动物宿主，在HEV传播过程是一个重要的病毒储存 库。已证实食用被HEV污染而未煮熟的猪肉、猪肝而患急性 戊肝。大量的数据显示从事养猪业或猪肉加工业相关的人员 HEV感染率要高于普通人群，因此家畜HE对养殖安全生产、 食品安全、公众身体健康等存在不可忽视的隐患。省兽医研 究所HE课题组研究结果显示，我省家畜尤其猪群普遍存在 HEV感染，市场销售的局部猪肝存在HEV污染。对于猪、牛、 羊等的HE的检测和诊断，目前尚无国家标准诊断技术规范。 现用于HEV的检测方法主要有免疫电镜法、免疫荧光法、传 统PCR法、Real-time RTPCR法、原位杂交法、ELISA法、血清中和法等。免疫电镜法与免疫荧光法稳定性差且灵敏度 低;传统PCR法假阳性率高；Real-time RTPCR法灵敏度高 但本钱高，难以在基层推广应用；原位杂交法虽可精确定位 病毒或其RNA组分，但也存在操作复杂的缺点;检测血清HEV 抗体的ELISA试剂盒，其敏感性和特异性尚不能令人满意; 血清中和法是证实戊肝爆发流行快速有效的方法，但其操作 复杂，也有非病毒成分导致假阳性的可能。巢式RT-PCR使 用两对引物（巢式引物:一对外引物和一对内弓I物）进行两次 PCR反响，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了特 异性，又有两对PCR引物与检测模板结合，敏感性和可靠性 大大提高。在此基础上，课题组结合广西戊肝的流行病学及 发病特点，研究出家畜戊型肝炎病毒检测巢式反转录聚合酶 链反响法应用于临床诊断，与上述方法相比，该方法具有更 好的特异性和更高的敏感性，该技术方法成熟可靠，临床应 用效果良好，易于推广应用。本工程制定检测HEV的推荐性地方标准，内容涵盖应用 PCR检测HEV的材料准备、操作方法及结果判定，建立家畜 HEV的快速、特异、灵敏的检测技术地方标准，为我省家畜 HE的综合防控体系提供诊断技术支撑，这对搞好我区家畜 HE的综合防控体系建设和人间HE预警预报与有效防控均具 有重要现实意义。2 .工程来源本标准为省质量技术监督局下达省兽医研究所承当的 20XX年第十二批省地方标准制定（修订）工程计划（X质监 函20XX884号），编号为20XX-12014 （属自筹工程），工程 定名为家畜戊型肝炎病毒检测套式反转录聚合酶链反响 法（送审稿）。3 .工作概况本标准起草团队(课题组)承当省科技攻关工程“猪源人畜 共患病综合防控技术研究与示范” (X科攻10100014-4). 省基本科研业务费专项课题“省猪群戊型肝炎病毒感染的 流行病学及病原学研究” (X兽研专项08-3)、“猪鸡牛羊 戊型肝炎流行病学研究及基因工程疫苗构建” (X科专项 10-1)及“动物源戊型肝炎实验动物模型的建立” (X科专 项ll-Do建立了 HEV的套式RT-PCR检测方法并已应用于临 床诊断，该方法灵敏、特异、快速，比常规RT-PCR具有更 好的灵敏性和特异性，技术方法成熟可靠，临床应用效果良 好。发表相关论文：“家畜戊型肝炎病毒诊断方法的建立及 应用”(中国人兽共患病学报，20XX, 27 (H)： 1051-1053),“省群戊型肝炎病毒感染情况调查”(中国动物检疫，20XX, 28(10) ： 46-48 )，“省14市猪戊型肝炎的分子流行病学 分析”(基因组学与应用生物学，20XX,29 ( 3 )： 464-470)，“猪戊型肝炎病毒广西株0RF2三段连续基因编 码蛋白的表达及抗原性分析”(中国兽医科学，20XX, 40(06)： 556-560, “省猪戊型肝炎血清流行病学调查”(省农业科 学，20XX, 41 (4) ： 383-385), “省猪鸡牛羊戊型肝炎血清 流行病学调查分析”(南方农业学报，20XX, 43(1) ： 103-106) 等。上述技术保障确保能优质完本钱标准起草制定任务。本标准起草团队从20XX年底开始地标制订工作， 确定标准编写目标和依据，同时起草制（修）订省地方标准 工程建议书，积极开展标准的申报。20XX年10月下旬接到 省质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）工程计划的 通知后，迅速成立标准起草工作小组，确定标准起草编写方 案及时间进度表，并积极组织实施。已完成标准初稿的编写 以及标准测试和验证工作。并按GB/T1. 1标准化工作导那么 第一局部：标准的结构和编写规那么要求完成标准征求意见 稿的编写，并分别送有关生产、技术推广、科研、教学和标 准化管理等单位的省较为权威专家和有实践经验的技术人 员（12人），征求各方面意见，并对反响意见进行汇总、整 理，修改补充标准征求意见稿，起草形成标准送审稿，同时 修改完善标准编制说明。本标准起草人员：XXX等。二、标准编制原那么.政策性原那么本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。1 .先进性原那么以国内外相关文献资料为参考，力求反映该领域最新的科技 成果。以国内同类标准制订编写方法为基础，对本标准进行 规范、充实和创新，使之具有先进性。2 .经济性原那么本工程为自筹经费工程，因此在本标准编制过程，从获取信 息、起草、实验室及临床验证到形成征求意见稿的逐一环节, 在确保质量的前提下均力行节约，利用有限的经费圆满完成 各阶段编写工作。3 .适用性原那么本标准集国内外HEV的PCR检测技术的成功经验，并经实验 室与临床应用验证，且完全按照国家标准的要求编写，内容 全面，形式规范，可操作和实用性强。4 .协调统一性原那么本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国 内相关标准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不 与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。5 .规范化原那么本标准是严格按照GB/T 1.1的要求来编写的。三、标准主要内容及依据本标准的主要依据是参考有关文献资料，结合我国国情以及 我省实际，通过实验室研究试验及临床验证后，并参考其他 资料经室内、室间验证提出。本标准的主要内容是通过巢（套）式RT-PCR对临床病料样 品或者细胞培养物中HEV进行快速检测与诊断。本标准的建 立过程主要进行了以下试验：1 .试剂和材料主要试剂RNA抽提试剂、反转录试剂、PCR试剂、电泳试剂、其他试 剂主要毒株和PCR引物序列用HEV参考株NNA-1株作为HEV阳性对照。相关病毒及DEPC H20 （无Rnase双蒸水水）作阴性对照。特异性引物序列及扩增片段长度引物种类引物名 特异性引物的核甘酸序 扩增片段长称列度（bp）外套引物HEV-A5'-TAY CGH AAY CAA GGH 524TGG CG-35（第1次HEV-B5' -TGY TGG TTR TCR TARPCR引物）PCR引物）TCC TG -3'内套引物内套引物HEV-F-ATW CAT GGV TCR CCT 328GTG AA -3,（第2次HEV-R5' -AAA TYA ATT CTG TCGPCR引物）PCR引物）GRA GC 3'1.1 检测样品从广西各地采集疑似HE病例猪、牛、羊的肝脏及粪便等样 品进行HEV检测。2待检样品的准备 2.1肝脏样品等组织的准备