常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第2部分疾病诊断与防治.docx

常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第2部分疾病诊断与防治1范围本标准规定了常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术的问诊与调查、初 步诊断、实验室确诊、细菌药敏试验、疾病综合预防及疾病治疗。本标准适用于XX省境内常见淡水养殖鱼类疾病的诊断与防治。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文 件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其 最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY 5071无公害食品 渔用药物使用准则3问诊与调查3.1 总则结合鱼类体表症状检查进行问诊和调查，并按常见淡水养殖鱼类 疾病诊治技术规范第1部分附录A填写疾病流行病学调查表。3.2 问诊基本情况了解内容包括：养殖场情况（名称、地址、水源类型、养殖面积、养 苔于水滴上，混匀后涂成薄膜，自然风干后进行革兰氏染色。革兰氏 染色紫色为阳性、红色为阴性。5.2.5 氧化酶试验无菌条件下，将纯化好的菌落平板打开，在菌落上加滴一滴氧化 酶试剂，Imin2min内，菌落呈现深紫色或蓝色为阳性，不变色为 阴性。5.2.6 接触酶试验（适用于革兰氏阳性菌球菌）无菌条件下，取细菌置于洁净的玻片上，然后加3%过氧化氢数 滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察 结果。产生气泡为阳性，不产生气泡为阴性。5.2.7 细菌鉴定根据分离到的细菌革兰氏染色、氧化酶和接触酶特性选择适合的 生化试剂条进行病原菌的生化试验，按生化试剂条要求和使用说明将 结果录入微生物鉴定系统，根据系统出示结果判断细菌的种属。也可利用全自动细菌鉴定仪鉴定或特定基因片段的PCR、16S rRNA等检测技术鉴定分离到的细菌。5.2.8 致病性试验用无菌生理盐水或无菌PBS液稀释菌落，制成菌悬液，采用肌肉 （或腹腔）注射、创伤涂抹、浸泡等感染方式，感染同品种的健康鱼 类（血清检测阴性）。感染后8 h观察1次，之后每天观察3次，连续观察15 d试验鱼的活动情况、发病症状和死亡情况等；对濒死试验鱼进行解剖，观察记录试验鱼的病变症状。感染后，试验鱼出现与自然发病鱼相同症状并死亡的，判断分离 到的细菌具有致病性。取濒死试验鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑等组织 进行细菌分离鉴定，鉴定结果与原分离到的细菌结果一致，判断分离 到的细菌为病原菌。5.3病毒病确诊3.1取样取活鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织，体长W4 cm的鱼苗取整条 活鱼（带卵黄囊的个体除去卵黄囊），体长4 cm6 cm的鱼苗取活鱼 的包括肾脏和脑在内的所有内脏；体长6cm的鱼取活鱼的肝脏、脾 脏、肾脏及脑组织。5.1 .2样品处理先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再用培养液按1 ： 10的最终 稀释度重悬于含有1 000 IU/mL青霉素和1 000 u g/mL链霉素的培养液 中。于25下孵育2h4h或4下孵育过夜，以释放病毒。离心力8 000 g离心20 min,收集上清液。5.2 .3病毒分离对1:10的组织匀浆上清液再作两次1:10的稀释，然后将这1:10, 1： 1001:1000三个稀释度的上清液接种新鲜的相应敏感细胞单层 的96孔板中，每孔接种100 HL稀释液。吸附lh后，加入细胞培养液， 置于25±2培养。分离试验中设2孔阳性对照和空白对照（未接 种病毒的细胞）。5.3 .4观察阳性对照和待测样品都接种细胞后，7 d内每天用40倍100倍 倒置显微镜检查。空白对照细胞形态应保持正常。如果阳性对照细胞 出现了CPE,检测样品的细胞培养中出现CPE时，应立即进行鉴定。如 果没有CPE出现，则再培养7 d后还要再盲传一次，然后进行鉴定。5.4 .5病毒的鉴定经过细胞分离病毒后，用RT-PCR、ELISA或者直接电泳检测病毒 核酸，任何一项检测结果为阳性者可确诊病毒病。6细菌药敏试验总则按常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第1部分附录C填写药 敏试验结果记录表。5.5 细菌扩培无菌条件下，用经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物, 以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。或挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液均匀涂布于 平皿培养基表面。5.6 贴药敏片将镜子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片均匀贴到平皿培养基 表面，一般每个平皿培养基可贴5片。5.7 培养将贴有药敏片的平皿培养基置于37 c生化培养箱中培养24 h后 取出平皿培养基测量各菌落的抑菌圈直径（单位:mm）。6. 5 结果判定根据测量得的抑菌圈直径大小，按照美国临床实验室标准化委员 会（NCCLS）最新版的药敏试验标准判断药物是否敏感。7疾病综合预防保持良好的养殖水体环境6.1.1 池塘养鱼控制水质的措施清塘苗种放养前7d10d,彻底清除池底污泥和对池塘水体及四周进 行消毒。6.1.1.1 排污换水适时将养殖水体底层的污水和表层的油膜排出，加注新水，保持 合适水位。6.1.1.2 合理开动增氧机增氧养殖前期，根据鱼类活动情况及天气、水质情况适时开增氧机增 氧；养殖中后期，每天清晨及晴天午后各开增养机增养1次，每次2h 3 h,高温季节，每次增加lh2h。6.1.1.3 适时使用水质改良剂养殖水体透明度小于20 cm时，用硫代硫酸钠改良水质。6.1.2 网箱养鱼控制水质的措施选择良好的水域设置网箱选择水质状况良好、不受工业污水、医院污水和城镇居民生活污 水影响、水面宽阔、水流较平稳、水流在0. 05m/s-0. 2m/s.水深4m 7 m的水域设置网箱。6.1.2.1 科学设置网箱“品”字型或“一”字型设置网箱，网箱间距应保持在5m以上。6.1.2.2 定期更换网箱设置区域网箱养殖一个生产周期后，应更换网箱设置区域，新设置网箱区 域离原区域100 m以上。6.2 放养健康的苗种放养体色正常，体表完整，健壮活泼，规格整齐，无伤病的苗种， 最好放养抗病品系苗种或人工免疫过的苗种。苗种放养前，必须经检 疫合格，并根据池塘条件、水质和饵料状况、饲养管理技术水平来调 节放养密度。6.3 科学投喂饲料3.1饲料选择根据养殖鱼类的食性，选择适合的饲料。7. 3.2科学投喂采取少量多餐投喂，日投喂量要适宜，配合饲料的日投喂量控制 在2. 5%左右，青饲料的日投喂量控制在10%左右。每次投喂前要参考 前次投喂时鱼的吃食情况，以便调整投饵量。避免投喂霉变饲料。8. 3.3定期投喂免疫增强剂每隔15 d拌饲料投喂酵母培养物或酵母细胞壁或黄苗多糖等免疫 增强剂，连续投喂3 d5 d, 1次/d。7.4做好日常管理工作. 4.1细心操作日常饲养管理过程中应细心操作，避免养殖鱼类受伤。7 .4.2巡逻检查每天巡查1次2次，巡查时注意观察养殖鱼类的活动、体色、摄 食、养殖水体的水色和透明度等情况，必要时可测定水温、溶氧量、 pH、氨氮、亚硝酸盐等水质指标。发现异常，及时采水样和病样送实 验室诊断。7. 4.3药物预防苗种放养前进行消毒，养殖期间，每隔15 d全池泼洒二氧化氯或 聚维酮碘或强氯精等消毒剂消毒1次，暴雨前后各泼洒生石灰水一次。7.4.4注意切断病原体的传播途径切断病原体的传播途径应遵从以下原则： 不从发生疾病的水体引入水和养殖动物，严格对发生疾病的 水体和在发生疾病的水体用过的器具进行消毒。 严格对病死鱼进行熟化等无害化处理。 养殖期间，每隔7 d对食场消毒1次，每次投喂饲料前清除 食场里的残余饲料。 发病水体的鱼类治愈前不得向外移殖。8疾病治疗病毒性疾病治疗8.1.1 改良水质用硫代硫酸钠全池泼洒改良水质O8.1.2 水体消毒用二氧化氯消毒水体，1次/d,连用3d。8.1.3 内服敏感药物拌饲料内服三黄粉合剂（大黄：黄苔：黄柏二7 ： 2 ： 1）和黄黄多 糖等免疫增强剂，1次/d, 5d7d为一个疗程，连用1个2个疗程。8.2 细菌性疾病治疗消除病因根据病因诊断结果，水质不适的，用硫代硫酸钠改良水质；饲料 质量较低或投喂方法不科学的，更换饲料品牌或调整投喂方法。8.2.1 水体消毒结合病症和养殖品种，从生石灰、二氧化氯或季铁盐碘等药物中 选择1种对养殖水体进行消毒，1次/d,连续3d。8. 2. 3内服敏感药物根据药敏结果拌饲料内服敏感国标渔药和黄芭多糖等免疫增强 剂,1次/d,连续5 d7 d。8.3 真菌类疾病治疗用五倍子末全池泼洒，1次/d,连续2 d3d。8.4 藻类疾病治疗全池泼洒生石灰，使养殖水体呈20g/m3Mg/V浓度，调整养殖 水体呈中性或弱碱性可抑制藻类繁殖。8.5 原虫类疾病治疗车轮虫、斜管虫、纤毛虫等体表和鳏寄生的原虫病治疗全池泼洒苦参末或硫酸铜和硫酸亚铁（5： 2）合剂，间隔3d4 d,再泼1次。8.5.1 胞子虫病治疗5. 2.1体表和鲤寄生的胞子虫病治疗用苦参末或槟楝复合液全池泼洒，间隔3 d4 d,再泼1次。8.5.2 5. 2, 2体内寄生的胞子虫病治疗拌饲料投喂地克珠利预混剂或50%盐酸氯苯胭粉，1次/d,连喂5 d7 do小瓜虫病治疗用高碘酸钠或浓（稀）戊二醛溶液或小瓜敌杀（主要成分为槟榔、 苦参、姜粉）遍洒，1次/d,隔5d7d用1次，连用3次；同时，每公 斤鱼用0.3 g0.4 g青蒿末拌饲料投喂，1次/d,连喂5 d7 d。8.6 蠕虫类疾病治疗8. 6.1体表和鲤寄生的蠕虫病治疗全池均匀泼洒甲苯咪嗖溶液或雷丸槟榔散，隔5 d6 d再用1次; 同时，拌饲料投喂苦参末或驱虫散，1次/d,连喂5 d7 d。8. 6.2体内寄生的蠕虫病治疗拌饲料投喂2对此唾酮预混剂或复方阿苯达哇粉，1次/d,连喂3 d 4 do甲壳类疾病治疗全池泼洒硫酸铜和硫酸亚铁(5 : 2)合剂或90%晶体敌百虫，每 隔5 d用药1次，连用3次。8.7 网箱养鱼外用药物的使用方法网箱兜布浸浴法按照网箱箱口规格，用彩条布连水带鱼兜住整个网箱，充气机充 气增氧或氧气瓶充氧，按围住水体计算用药量，浸浴2h4h。8.7.1 泼洒法将药物放入50L塑料桶内加适量水调匀后，均匀泼洒于网箱及网 箱四周3m以内、上水处5nl以上的水面。用药量按1亩1 m水深池塘的 用药量用于20疔30 nf网箱。8.7.2 挂瓶法在塑料瓶扎若干孔径为0. 3 cm0. 5 cm的小孔，装入药物和石头,封口，吊挂于网箱中间及四角0.6m和2m水深处。 殖模式、负责人及联系电话）、发病水域情况（池塘或网箱编号及水 体面积、水深、底质、清塘方法及设施条件，放养情况（放养种类、 苗种来源、放养日期、放养规格和密度）、养殖模式，管理情况（清 塘、免疫、消毒情况，消毒药物名称、主要成分、用量和用法），投 饲情况（饲料品牌、日投喂量、日投喂次数、投喂方法）及近期引种 和捕捞操作情况。3.2.2 了解养殖水域环境状况包括水源类型、水域水质及周围植被、有无污染源、周围农作物 用药情况，以及养殖水体水深、底质情况、禽畜套养或施放禽畜粪肥、 人为倾倒垃圾、农田施药、电炸毒及降雨、风况、汛期等情况。3.2.3 询问病史了解周边养殖场、发生疾病的养殖场及水体历年和近期疾病的发 生及损失等情况。3.2.4 询问病情了解发生疾病的鱼类种类、规格、病程，以及死亡种类及顺序、 死亡规格和数量等。3.2.5 询问对疾病的防控措施了解发生疾病的水体已经采用的防治措施，包括进排水、投入品 使用、人员与工具消毒与隔离、废弃物处理，以及采取措施后的疗效 等，特别是用药品种、生产厂家、用法用量等。8.8.4虹吸灌注式方法在上水面的网箱架两个角及中间各放1个50 L塑料桶，将药物放 入桶内加满水调匀后，用内径为10 mm30 mm塑料软管将桶里的药液 虹吸出来，缓慢流入网箱水体中，塑料软管入水0.6 m,控制流量保 持药液缓慢流入网箱水体lh2h, 1次/d,连用2d。用药量按1亩1m 水深池塘的用药量用于20 30 网箱。1.9 渔药使用疾病防治用药应符合NY 5071无公害食品渔用药物使用准则的 规定。1.10 6询问近期天气和水质情况了解近5 d的天气和水体水温、水色、浑浊度等水环境的变化情 况。3 . 3现场检查3. 1总则结合鱼类体表症状观察开展现场检查，并按常见淡水养殖鱼类疾 病诊治技术规范第1部分附录A填写疾病流行病学调查表。3.1.1 水质因子检查观察记录发生疾病的水体进、排水情况，水体水色；检测水温、 浑浊度、透明度、pH值、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等水质指 标。3.1.2 观察鱼类体表、活动及摄食情况观察发生疾病的水体的养殖鱼类体表有无异常现象，了解发生疾 病的水体鱼类的活动、摄食等情况。4初步诊断1总则根据问询及现场检查结果对疾病进行初步诊断，并按常见淡水养 殖鱼类疾病诊治技术规范第1部分附录B填写实验室检测记录表。3.2 采样采集症状典型的濒临死亡或刚死不久的鱼类；病症不明显的，采集离群独游的鱼类。每个病样的数量不能少于5尾。3.3 鱼类体表症状检查选择濒死或刚死不久、症状典型的病鱼置于白色瓷盘中，仔细观 察其体色及头部、吻部、须、眼睛、鲤盖、鳞片、鳍条、肛门等部位， 看有无充血、发炎、溃烂、脱鳞、棉絮状物体、变色、粘液增多、粗 糙、肿胀、红点或白点、畸形等病症及肉眼可见的大型寄生虫，并做 好记录和拍照。检查数量通常为3尾5尾。3.4 解剖检查. 4. 1 鲤剪开病鱼鲤盖，观察记录鳏的颜色、质地、缺损、包囊、积污、 寄生虫等情况。4 .4.2肌肉剥掉病鱼鱼皮，观察肌肉是否出血或其他异常。5 .4.3内脏器官剖开病鱼腹腔，观察记录是否有腹水及肝脏、脾脏、肾脏、胆囊、 鳗、肠道、腹腔内膜是否有白点、红点、包囊、充血、肿胀等病变情 况；然后剖开肠道，观察是否有肉眼可见寄生虫。4.5镜检5. 1体表黏液检查在干净的载玻片上加一滴清水，用盖玻片刮取病鱼体表、胸鳍、 腹鳍、尾鳍上的棉絮状物或白点等异物或黏液，将刮取物置于载玻片 的水滴上用盖玻片轻压，显微镜下按先低倍镜后高倍镜进行镜检，主 要检查有无小型寄生虫或其他病原体。4. 5,2罐丝水浸片检查在干净的载玻片上加一滴清水，剪取少量螺丝置于载玻片的水滴 上，盖上盖玻片，先低倍后高倍进行镜检，观察鳏丝的病变情况及检 测是否有寄生虫或其他病原体。5. 5.3病变组织涂片或压片检查5. 3.1病变器官取病鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织均匀涂于干净的载玻片上， 滴加清水或生理盐水，盖上盖玻片并轻压，显微镜下先低倍镜后高倍 镜观察，检测是否有寄生虫。6. 5. 3. 2病变肌肉取少量病鱼病变肌肉置于干净的载玻片上，滴加清水或生理盐水, 用一新的载玻片盖上，压片，显微镜下先低倍镜后高倍镜观察，检测 是否有霉菌或寄生虫。6.5. 3.3 包囊取病鱼的鳏或内脏器官上的包囊于干净的载玻片上，滴加清水或 生理盐水，盖上盖玻片并轻压，显微镜下先低倍再高倍镜观察，检测 是否有寄生虫。4.5. 3.4血涂片取病鱼血一滴置于载玻片的右端,另取一边缘平滑的载玻片作推 片，左手持载血玻片的左端,右手持推片的一端，将推片的另一端从 血滴左侧向右移动，当血滴均匀地附着在两片之间后，再以两片成 30°45。夹角将推片向左平稳地推移至推片上无血液成均匀的血 膜。然后以瑞氏染液染色制成血涂片，于显微镜下进行镜检，检测是 否有寄生虫。4.5.4内脏器官组织涂片染色检测4. 5. 4. 1细菌观察取病鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织均匀涂于干净的载玻片上, 阴干，革兰氏染色后油镜下观察，检测是否有细菌。4. 5. 4. 2病毒包涵体观察取病鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织均匀涂于干净的载玻片上, 阴干，E染色，阴干，油镜下观察，检测是否有嗜酸性或嗜碱性的 病毒包涵体。4. 6初步诊断结果 4. 6, 1总则根据显微镜检测结果，结合调查问诊、现场检查和解剖检查 结果，进行初步诊断。4. 6.2真菌类疾病从体表上的棉絮状物体镜检到霉菌的确诊为水霉病，在鲤血管内 检测到霉菌的确诊为鲤霉病，在病变肌肉上检测到霉菌的确诊为流行 性溃疡综合症（丝囊霉菌病）。4. 6.3藻类疾病从体表和鳍条上的白色小点镜检到大量呈肾脏形的嗜酸性卵甲 藻的确诊为嗜酸性卵甲藻病（打粉病）。4. 6.4原虫类疾病除抱子虫直接描记抱子数量外，从体表黏液或鳏丝上镜检到原虫, 体长5cm以下的鱼，3个视野的平均虫体数在20个以上；体长5cm以上 的鱼，3个视野的平均虫体数在50个以上，确诊为原虫病，根据观察 到的原虫种类可确诊到属。4. 6.5蠕虫类疾病从体表黏液、鳏丝、肠道等部位上镜检到蠕虫，体长5cm以下的 鱼，3个视野的平均虫体数在2个以上；体长5 cm以上的鱼，3个视野 的平均虫体数在5个以上，确诊为蠕虫病，根据观察到的寄生虫种类 可确诊到属。4. 6.6甲壳类疾病肉眼观察到病鱼体表附着有虫体，体长5cm以下的鱼，平均虫体 数在2个以上；体长5cm以上的鱼，平均虫体数在5个以上，确诊为甲 壳类病，根据观察到的种类可确诊到属。4. 6.7细菌性疾病病鱼肝脏、脾脏、肾脏、脑组织涂片染色镜检观察到细菌，解剖 检查病鱼腹腔有腹水，初步诊断为细菌性疾病。4. 6.8病毒性疾病病鱼肝脏、脾脏、肾脏、脑组织涂片染色镜检观察到嗜酸性或嗜 碱性包涵体，初步诊断为病毒性疾病。5实验室确诊总则按常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第1部分附录B填写实验 室检测记录表。5.1 细菌病确诊取样在采集或接收的病样中，取病症明显的濒死或刚死个体，将体表 擦干并用75%酒精棉球擦拭消毒,无菌条件下剪取肝脏、脾脏、肾脏、 脑等器官及病灶部位肌肉组织放置于无菌培养皿中，用75 %酒精棉球 擦拭消毒各器官组织表面待用；体长3 nd以下的鱼苗取全鱼（带卵黄 囊的个体除去卵黄囊），消毒体表后置于无菌碾钵中碾成肉糜待用。5.1.1 细菌分离在超净工作台上将所取病鱼组织以紫外灯照射15min,用经酒精 灯火焰烧灼杀菌的剪刀分别在所取各组织器官上轻轻烫一下，在烫处 剪开一个小口，用酒精灯火焰灭菌后的接种环伸入组织器官内轻轻搅 动，划线接种于血琼脂培养基平板或脑心浸液培养基平板上。接种完 后，在皿底上应记录样品编号、样品名称、取样部位、取样日期。怀 疑为爱德华氏菌病、流行性溃疡综合症、烂鲤病的，还需用选择性培 养基平板划线分离细菌，倒扣平皿于28 C或37 c生化培养箱中培养 24 ho检查是否有菌落生长。注：细菌分离的每一步操作前、后，解剖剪、解剖刀、镶子、接种 环等用具都要在酒精灯火焰上烧灼灭菌，以免交叉污染。5.1.2 细菌纯化无菌条件下，用灭菌后的接种环挑取单个菌落，接种到普通琼脂 培养基平板上，于28 或37 生化培养箱中培养24 h。5.1.3 革兰氏染色在无油迹的干净载玻片的片端注明制片日期、片号等，滴一小滴 无菌蒸储水于载玻片中央。用酒精灯火焰灭菌后的接种环挑取少许菌