2023年蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告.docx

蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级：HE姓名：学号：加酪素1. 0 0 ml （摇匀）加三氯乙酸2.00 mL （摇匀）取出静止lOmin,过滤取出静止10mi n ,过滤取1. 00mL滤液取1. 0 0mL 滤液加碳酸钠溶液5. 0 mL加碳酸钠溶液5.0mL加福林酚试剂1. 0 0mL加福林酚试剂1.00mL40±0, 2° C 显色 20min4 0 ±0. 2 0 C 显色 201n i n于680nm波长，用1 0 mm比色皿于6 80nm波长，用1 0 mm比色皿测其吸光度测其吸光度将测定的0D68。值填入下表培养时间（h）对照组调0测定0 D680值(A)样品0D6 80值(A)000.3070.30 7600. 5570. 5571200.6060. 6061800. 7650.7652400.98 60. 9 863001. 2251. 2253601.33 71.3375.1酶活力的计算根据酶活计算公式将数据填入下表培养时间（h）061218243036能活力（U/ml）1 1202 127354347酶活力(U/ml)第五章结果与讨论通过酶活力的曲线可以看出在36 h左右酶活力达成最大,此时发酵液中的产蛋白酶最 多。所以在选择发酵时间时，应选择36h为最大产酹时间点。掌握了蛋白酶产生菌的生长曲线绘制方法，同时通过研究蛋白酶的性质及学习其测定方法, 用微生物学方法测定蛋白酶的酹活力。第六章参考文献1 Mala B R a o , APama M. t alk a s 1 e, Moh i ni S. G h a tge, et aL. Mo 1 e c ular and io t ech o lo g 1 eal a spect s o f microbi a 1 prote a seM. Mia e b i ology a nd Mo 1 e cular Biolog y e v i ew, s ept. 199 8:5 9 76 3 5.2罗贵民.酶工程 M.北京:化学工业出版社,202 3 .3黄文涛，胡学智.译酶应用手册M,上海科学出版社，1989.4夏凡,理争艳.微生物碱蛋白酶在食品工业中的应用及其安全性研究进展J.山东食品 发酵，202 3 , ( 2 ): 1 9-2 2 .5中华人民共和国专业标准：蛋白酶活力测定法，SB/T： 10317-19 9 9.摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酹，广泛应用丁食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。当前，食品工业用酶重要来自微生物，特别是蛋白酶的应用最为广泛。作为i种生物催化剂,它具有催化反映速度快,无工业污染，催化反映条件适应性宽等的性质和优点。由于从植物和 动物中生产蛋白酶具有的局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投 到微生物蛋白酶上。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性 及其遗传可操作性等特点，因而备受人们青睐。本文重要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌 种最佳发酵产能时间等方面的研究。关键字：蛋白酶 生长曲线 酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶，它作用于蛋白 质，将其分解为蛋白豚、多肽及游离氨基酸用，约占酶总量的60%,其中碱性蛋白酶就占2 5%。有调查显示，酹制剂市场量最大的是洗涤剂用陋，第二位是淀粉加工用陋，以后依次为 乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶。与动、植物来源的蛋白酶相比, 运用微生物产的蛋白能有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产， 培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。1. 2国内外研究概况.1微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越 来越多地把目光投到微生物蛋白酣上。当前工业用酶重要来源于微生物，微生物来源的蛋 白酶按其作用的pH值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酷及酸性蛋白酶，它们 作用的最适PH值分别为碱性、中性及酸性。1.1 . 2在食品工业中的应用蛋白酹在食品工业上的应用重要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩 化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽泡杆菌、 地衣芽泡杆菌、米曲霉和黑曲霉等。随着社会发展和生活水平不断提高，人们对肉类的需求量日益增长的同时，对肉的品质 也提出了更高规定。微生物蛋白悔肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂，在适当温度下，可以断裂蛋白质中的某些肽键,提高肉的嫩度，使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼，提 高了肉的成品率、保质期和经济效益，因此十分经济且便于生产，并能取得显著效果。面包 制作过程中，面粉中具有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。用米曲 霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解，可改善面团操作性能和机械性能，以适应不同制 品的需要。陋解决后的面团其韧性和机械强度都有所增长。过品使用蛋白酶能减少面团的混 合时间和增长面包产量。使用细菌蛋白酶可以增长面团的延展性匕3本实验的研究内容通过研究产蛋白酶菌来了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线，了解蛋白 酶的性质及蛋白酶的测定原理,掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法和掌握一定的知识与技 能。第二章材料与设备菌种产蛋白酷芽胞杆菌培养基2. 2.1牛肉者蛋白陈培养基2.2. 2酪素培养基3重要试剂材料福林试剂、0. 4 moi/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0. 5mol/LNa OH溶 液、Imol/L和0. Imol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(PH= 10. 5)、10g酪素溶液、100ug /mL L 一酪氨酸标准溶液4重要仪器设备UV 1 0 0 0分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、 离心管、枪头、摇床、培养基第三章 分析测定方法1. 1福林-酚试剂法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（铝蓝和鸨蓝混合物），由于蛋白 质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反映。 因此可运用此原理测定蛋白睡活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同 酶液反映,经一段时间后终止能促反映,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用 Na2c03碱化,再加入福林一酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸最成正比； 酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。3.2蛋白酶活力测定方法按中华人民共和国专业标准SB/T 10317-19 9 9:蛋白酶活力测定法测定。3.2. 1标准曲线的制作加完之后，置于4 0 + 0.2水浴中显色2 0 min,取出，用分光度计于波长6 8 0 n m, 10mm管号酪氨酸标 准溶液的 浓度ug/ml取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml取去离子水的体积ml力口 0 . 4 m o1/L的碳酸钠溶液的体积ml加福尔马 林的体积 ml测 定0D680 值(A)000. 01. 05. 0 01. 0001100 . 10. 95.0 01.000.08 92200.20. 85. 001. 000. 1 793300.30. 75.001.000. 3534400.40.65.001. 000.4795500. 50.55. 0 01.000.51 8比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，酪氨 酸的浓度C为横坐标,绘制标准曲线，计算出0D68 0 =l时的浓度，即为吸光常数K值。酪氨酸标准溶液的标准曲线酪氨酸浓度（ug/ml）计算出0D 680时的浓度，即为吸光常数K值，K=8 8. 2 8<.3. 2.2的活力数值计算:X= AXKX4/10Xn式中：X一一样品的能活力，U/mL;A一一样品平行实验的平均吸光度；K一一吸光常数；4一反映试剂的总体积，mL； 1 0反映时间10m i n,以Imi n计;n稀释倍数。所得结果表达至整数。第四章实验方法1实验流程培养基的配置一活化菌种f培养取样一标准曲线绘制、生长曲线绘制和酹活测定4.2培养基的制备4.2. 1牛肉膏蛋白陈培养基制备配方：牛肉膏 0.3g、蛋白陈 1.0g、NaCl 0.5g、水 1 000m 1、pH7. 07. 2、121灭菌20minP4. 2. 2酪素培养基制备牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl 4-5g/L PH 7. 2-7. 4先将酪素用少量2与氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸储水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解(10-15min )，补足1 0 0 0 mL蒸储水，加入其他成分，调PH分装灭菌。2. 3菌种活化将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150 ml液体发酵培 养基(牛肉膏蛋白陈培养基)的2 50 ml三角瓶中，30-32 摇瓶发酵，在摇床里30震荡 培养16到18小时，目的在于活化菌种并得到对数期菌种。在培养瓶中进行发酵。2.1 试剂的配制1. 4.1福林一酚试剂：向2023m L的磨口回流瓶中加入100g铛酸钠(Na2WO4. 2H 2 0)、 25g钳酸钠及7 00mL的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸10 0mL,充足混合后, 接上回流冷凝管，以文火回流10 h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子 水及数滴滨水，再继续沸腾15min,以驱除过量的浪，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色, 需再反复滴加浸水的环节)，加去高子水定容至100 0 mL乱，过漉，滤液置于棕色试剂瓶中， 贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1： 3比例用去离子水稀释。2. 4. 20.4m。1/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA 6 5. 4 g,加去离子水定容至10 0 0mLo 4. 4.0.4mo 1 / L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42. 4 g,加去离于水溶解后,定容至1 OOOniLo3. 4. 4 氢氧化钠溶液 c(Na0H)=0. 5mo 1 /L4. 4. 5 盐酸溶液 c (HCI) = 1 mo 1 /L 及 0. 1 mol/L5. 4. 6磷酸缓冲液(pH =7. 5 ),合用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na,HP0,- 12H, 0)6. 02 g 和磷酸二氢钠(Na H, PO, 2H,0) 0. 5g , 加水溶解并定容至I 0 0 0 mL6. 4. 7 lOg/L酪素溶液称取酪素1. 000 g，精确至0. 0() 1g,用少量0. 5m ol/L氢氧化钠溶液湿润后,加人适量的各 种适宜P H的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转人1 0 0 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。a 4. 4 . 810 0 口 g/m L酪氨酸溶液：精确称取0. 10 0g酪氨酸,逐步加入Imo 1 / L盐酸6ml溶解后，用0. Imol盐酸定容至1 00mL得ling/ml酪氨酸溶液,取此溶液1 0mlImol盐酸定容到1 0 0ml,放入4度冰箱中保存。2.2 产蛋白酶菌生长曲线的测定4. 5.1获取不同培养时间发酵液4.5. 1. 12023年12月1 1号,星期三，整点8:00时,准时接入已经活化好的对数期菌种，用1 OOOul的移液枪吸取5ml的对数期菌液加入到发酵瓶A中卜液体为酪素培养 基），剩下的对数期菌种菌液置4 C冰箱种中保藏于%并同时将A号发酵瓶放到摇床中， 继续3 0 °C震荡发酵。在直到20:00时将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌利。取 出5ml接种到B号发酵瓶中。并放在30C的摇床中继续发酵。4.6. 1.22 0 23年12月1 2号，星期四，在8： 0 0时,将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5m 1接种到C号发酵瓶中。立即从A、B、C号瓶移取发醉液5 ml到相应的离心管中。A瓶取样分别相应的编号是12、13、14、15、1 6、17、1 8相 应培养时间为2 4 h、2 6h、2 8h、301k 32h、3 4h、36h。B瓶取样分别相应的编号是6、 7、8、9、10、11相应培养时间为12h、14h、1 6h、1 8 h、2 Oh、2 0 h完毕所有取样。 C瓶取样分别相应的编号是0、1、2、3、4、5相应培养时间为Oh、2h、4 h、6h、8h、 10ho并且所有放到4度冰箱封存。吸光度值的测定将编号 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1 8 的离心管从冰箱里取出，用离心机在设定的转速为350 0 rpm,离心10m i n,将要测能活力的 的编号的上清液倒入另一干净的试管中。沉淀留下。（2）离心管中加入蒸储水5ml轻微震荡制成悬浮液。（3）将悬浮液加到比色皿中，测其吸光度值。测定的0D6”值填入下表。编号 对照 ()12345678发酵时0246810121416间(h)光密度0.96值OD60000. 1820.3 470. 4520. 6780. 9060. 91351.3191.546编号9101 1121 314151 61 718发酵时1 8202224262830323436间(h)光密度1 . 51.7261.741. 8251.9191. 9761.9811.972 . 02 . 1值ODw8520415 1Gqv)a超定亲吸光产蛋白酶菌生长曲线0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 21 26 28 30 32 3 136 38 10时间(h)4.6酶活力的测定（1）待测液的制备：选择培养时间为0、6、12、18、2 4、30、36h的离心管，离心之后的上清液, 即为待测酶液。（2）将酪素、三氯乙酸溶液放入4 0±0. 2° C恒温水浴锅中，预热5m i no（3 ）按下表操作：试管A （空白）试管B （醐试样，需作三测量平行）加酶液1 . 00 mL加酶液1 . 00 mL40± 0.2° C,2min40±0. 2° C, 2 min加三氯乙酸2. 0 0 m L （摇匀）加酪素1.00ml （摇匀）40±0.2° C, lOmin40± 0 . 2° C, 1 Omi n