有关核酸提取与鉴定的最基本实验.ppt

有关核酸提取与鉴定的最基本实验有关核酸提取与鉴定的最基本实验哺乳动物细胞总哺乳动物细胞总RNA的提取与纯化的提取与纯化经典方法：异硫氰酸胍经典方法：异硫氰酸胍-酸酚法酸酚法实验原理：高浓度强变性剂异硫氰酸胍作用：实验原理：高浓度强变性剂异硫氰酸胍作用：a.可使细胞结构迅速破坏，释放出可使细胞结构迅速破坏，释放出RNA，包括核，包括核糖体糖体RNA。b.使使RNA酶失活，使释放出的酶失活，使释放出的RNA不被不被RNA酶酶降解。降解。采用酸性苯酚采用酸性苯酚/氯仿氯仿/异戊醇抽提细异戊醇抽提细胞裂解物时，蛋白质变性不溶，而在酸性胞裂解物时，蛋白质变性不溶，而在酸性pH条件下，条件下，DNA溶于酚相中，溶于酚相中，RNA仍留于水相仍留于水相中。取水相用冰异丙醇沉淀，中。取水相用冰异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤乙醇洗涤晾干后即可得到高质量总晾干后即可得到高质量总RNA。n商品化方法：商品化方法：trizol法法trizol法实验步骤法实验步骤n1.1.提取组织提取组织RNARNA时，每时，每5050100mg100mg组织（已研组织（已研磨成粉沫）用磨成粉沫）用1ml 1ml TrizolTrizol试剂进行裂解；提取试剂进行裂解；提取细胞细胞RNARNA时，先离心沉淀细胞，每时，先离心沉淀细胞，每5-10 5-10 10106 6个个细胞加细胞加1ml 1ml TrizolTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；荡以裂解细胞；n2.2.将上述组织或细胞的将上述组织或细胞的TrizolTrizol裂解液转入裂解液转入EPEP管中管中,在室温在室温15301530下放置下放置5 5分钟；分钟；n3.3.在上述在上述EPEP管中，按照每管中，按照每1ml 1ml TrizolTrizol加加0.2ml0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖紧管口，用力震荡氯仿的量加入氯仿，盖紧管口，用力震荡1515秒，秒，室温下（室温下（15153030）放置）放置2 23 3分钟，分钟，12000g12000g（2288）离心）离心1515分钟；分钟；n4.取上层水相置于新取上层水相置于新EP管中管中,按照每按照每1mlTrizol加加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（1530）放置）放置10分钟分钟,12000g（28）离心）离心10分钟；分钟；n5.弃上清，按照每弃上清，按照每1mlTrizol加加1ml75%乙醇乙醇进行洗涤，涡旋混合，进行洗涤，涡旋混合，7500g（28）离心）离心5分钟，弃上清；分钟，弃上清；n6.沉淀的沉淀的RNA在室温下自然干燥数分钟，用在室温下自然干燥数分钟，用Rnase-freewater溶解溶解RNA沉淀。沉淀。病毒病毒RNA的提取的提取n1 1、取鸡胚尿囊液，加入取鸡胚尿囊液，加入5-105-10倍体积倍体积 TrizolTrizol液，混匀；液，混匀；n2 2、室温放置室温放置5 5分钟，然后以每分钟，然后以每1ml 1ml TrizolTrizol液液加入加入0.2ml0.2ml的比例加入氯仿，盖紧管口，用手的比例加入氯仿，盖紧管口，用手剧烈摇荡离心管剧烈摇荡离心管1515秒；秒；n3 3、取上层水相于新取上层水相于新EPEP管，按每管，按每1ml 1ml TrizolTrizol液液加加0.5ml0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置1010分钟，分钟，12000g12000g离心离心1010分钟；分钟；n4、弃去上清液，按每弃去上清液，按每1mlTrizol液加入至少液加入至少1ml的比例加入的比例加入75%乙醇，混匀，乙醇，混匀，4下下7500g离心离心5分钟；分钟；n5、重复第重复第4步；步；n6、小心弃去上清液，然后室温干燥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，分钟，注意不要干燥过分，否则会降低注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；的溶解度；n7、将将RNA溶于溶于Rnase-freewater中中,紫外定量。紫外定量。附：磁珠分离附：磁珠分离mRNAmRNA试剂盒试剂盒n1 1、1.5mlEP1.5mlEP管中加入管中加入500500 L L待提取样品，加入待提取样品，加入400400 L L核酸提取液，震荡核酸提取液，震荡1010秒；秒；n2 2、将、将EPEP管置于管置于6060保温保温1010分钟；分钟；3 3、将、将EPEP管置于室温放置管置于室温放置1010分钟，转移到磁珠分钟，转移到磁珠分离器上，静置分离器上，静置5 5分钟；待磁珠吸附于管壁后，分钟；待磁珠吸附于管壁后，吸净管中的气泡和液体，保留磁珠；吸净管中的气泡和液体，保留磁珠；n4 4、向管中加入、向管中加入1ml1ml洗涤液，取下后震荡洗涤液，取下后震荡1010秒，秒，再置于磁珠分离器上，静置再置于磁珠分离器上，静置5 5分钟；重复步骤分钟；重复步骤3 3，共用洗涤液漂洗，共用洗涤液漂洗2 2次，最后尽量吸净液体；次，最后尽量吸净液体；5 5、若后续试验无特殊要求，加入、若后续试验无特殊要求，加入5050 L DEPCL DEPC处理处理H H2 2O O，震荡，使磁珠悬浮即可；，震荡，使磁珠悬浮即可；6 6、若需要将磁珠洗脱下来，可向管中加入、若需要将磁珠洗脱下来，可向管中加入50ul50ul洗洗脱液（脱液（DEPCDEPC处理处理H H2 2O O或或Long-term RNA Storage Long-term RNA Storage BufferBuffer），取下并震荡），取下并震荡1010秒，再将管置于恒温装秒，再将管置于恒温装置上置上6060保温保温5 5分钟；分钟；7.7.立即将上述立即将上述EPEP管重新置于磁珠分离装置上，静管重新置于磁珠分离装置上，静置置3 3分钟，保持样品处理管于磁珠分离装置上，取分钟，保持样品处理管于磁珠分离装置上，取出清液（弃磁珠），即为提取的出清液（弃磁珠），即为提取的RNARNA。RNA抽提注意事项抽提注意事项n1 1、器皿处理，塑料用、器皿处理，塑料用DEPCDEPC浸泡，玻璃用高温处理。浸泡，玻璃用高温处理。n2 2、样本要求：新鲜。、样本要求：新鲜。n3 3、操作温度：尽可能在、操作温度：尽可能在低温低温下操作，如液氮里或冰浴下操作，如液氮里或冰浴上。上。n4 4、操作过程防污染（口罩手套、环境干净）。、操作过程防污染（口罩手套、环境干净）。n5 5、每一步操作注意点：匀浆（完全）、每一步操作注意点：匀浆（完全）n 萃取（吸取上层的萃取（吸取上层的60%-70%60%-70%）n 沉淀、洗涤按操作规程沉淀、洗涤按操作规程n 干燥（不能用真空干燥，要自然干燥）干燥（不能用真空干燥，要自然干燥）n6 6、加氯仿前的匀浆液可在、加氯仿前的匀浆液可在-70-70保存一个月以上，保存一个月以上，RNARNA在在70%70%乙醇中可在乙醇中可在44保存一周，保存一周，-20-20保存一年。保存一年。n细菌质粒细菌质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化细菌的收获细菌的收获n收获收获n1 1）将）将2ml2ml含抗生素的含抗生素的LBLB加入到容量为加入到容量为15ml 15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于单菌落，于3030剧烈振摇下培养过夜。剧烈振摇下培养过夜。n2 2）将）将1.5ml1.5ml培养物倒入培养物倒入EPEP管中，于管中，于44以以12000g12000g离心离心6060秒。秒。n3 3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，注意吸头远离细菌沉淀。注意吸头远离细菌沉淀。细菌质粒细菌质粒DNADNA的提取与纯化（碱裂解法）的提取与纯化（碱裂解法）n1 1）将细菌沉淀，所得重悬于）将细菌沉淀，所得重悬于100100 L L用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液I I中，中，剧烈振荡。剧烈振荡。n溶液溶液I In50mmol/L50mmol/L葡萄糖葡萄糖n25mmol/L 25mmol/L Tris.ClTris.Cl（pH8.0pH8.0）n10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）n溶液溶液I I可成批配制，每瓶约可成批配制，每瓶约100ml100ml，在，在10lbf/in210lbf/in2（6.8956.895104Pa104Pa）高压下蒸气灭菌高压下蒸气灭菌1515分钟，分钟，贮存于贮存于44。须确使细菌沉淀在溶液。须确使细菌沉淀在溶液I I中完全分散，将中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。速分散。n2 2）加）加200200 L L新配制的溶液新配制的溶液。n溶液溶液n0.2mol/L 0.2mol/L NaOHNaOH（临用前用（临用前用10mol/L10mol/L贮存液现用现稀释）贮存液现用现稀释）、1%SDS1%SDSn盖紧管口，快速颠倒离心管盖紧管口，快速颠倒离心管5 5次，以混合内容物。应次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液确保离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。离心管放置于冰上。n3 3）加）加150150 L L用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液n溶液溶液n5mol/L5mol/L乙酸钾乙酸钾 60ml60mln冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5mln水水 28.5ml28.5mln盖紧管口，将盖紧管口，将EPEP管倒置后振荡管倒置后振荡1010秒钟，溶液秒钟，溶液在粘稠的细在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3 35 5分钟。分钟。n4 4）用微量离心机于）用微量离心机于412 000g412 000g离心离心5 5分种，将上清转移到分种，将上清转移到新新EPEP管中。管中。n5 5）可做可不做：加等量酚：氯仿，）可做可不做：加等量酚：氯仿，振荡混匀，振荡混匀，于于4 4 以以12000g12000g离心离心2 2分钟，将上清转移到另一新分钟，将上清转移到另一新EPEP管中。有些管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会影响限制酶切反应。的原因，省略这一步，往往会影响限制酶切反应。n6 6）用）用2 2倍休积的乙醇于室温沉淀倍休积的乙醇于室温沉淀DNA.DNA.振荡混合，于室温放振荡混合，于室温放置置2 2分钟。分钟。n7 7）用微量离心机于）用微量离心机于44以以12 000g12 000g离心离心5 5分钟。分钟。n8 8）小心吸去上清液，将）小心吸去上清液，将EPEP管倒置于一张纸巾上，以使所管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，将附于管壁的液滴除尽。注意吸头远离核酸有液体流出，将附于管壁的液滴除尽。注意吸头远离核酸沉淀。沉淀。n9 9）用）用1ml70%1ml70%乙醇于乙醇于44洗涤双链洗涤双链DNADNA沉淀，按步骤沉淀，按步骤8 8）所述）所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥1010分钟。分钟。碱裂解法提取细菌质粒碱裂解法提取细菌质粒DNADNA的原理的原理n溶液溶液：悬浮：悬浮n 50mmol/L 50mmol/L 葡萄糖葡萄糖n 25mmlol/L Tris25mmlol/L TrisCl(PH8.0)Cl(PH8.0)n 10mmol/L EDTA(PH8.0)10mmol/L EDTA(PH8.0)n 在在10 lbf/in10 lbf/in 2(6.8952(6.89510104pa)4pa)高压下蒸汽灭菌高压下蒸汽灭菌1515分钟，贮存于分钟，贮存于44n溶液溶液I I的作用：的作用：n50mM50mM葡萄糖：加了葡萄糖后悬浮后的大肠杆菌不会快葡萄糖：加了葡萄糖后悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部速沉积到管子的底部nTris-ClTris-Cl溶液：控制好溶液的溶液：控制好溶液的pHpHnEDTAEDTA：是：是Ca2+Ca2+和和Mg2+Mg2+等二价金属离子的螯合剂等二价金属离子的螯合剂n溶液溶液：裂解：裂解n 0.4mol/L 0.4mol/L NaOHNaOH n 2%SDS 2%SDSn临用前配制，临用前配制，1 1：1 1混合混合n破细胞壁的主要是碱，而不是破细胞壁的主要是碱，而不是SDSSDS，所以才叫碱法抽提。，所以才叫碱法抽提。n NaOHNaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从这是由于细胞膜发生了从bilayerbilayer（双层膜）结构向（双层膜）结构向micellemicelle（微囊）结构的相变化所导致。（微囊）结构的相变化所导致。n SDS:SDS:结合蛋白质结合蛋白质n溶液溶液：沉淀：沉淀n 5mol/L5mol/L乙酸钾乙酸钾 60ml60mln 冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5mln 水水 28.5ml28.5mln溶液溶液加入后，钾离子置换了加入后，钾离子置换了SDSSDS中的钠离子形成了不中的钠离子形成了不溶性的溶性的PDSPDS，而，而SDSSDS由于与蛋白质结合，钾钠离子置换由于与蛋白质结合，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组菌的基因组DNADNA因为与蛋白质结合也一起被共沉淀了。因为与蛋白质结合也一起被共沉淀了。n2M2M的醋酸：中和氢氧化钠，因为长时间的碱性条件会的醋酸：中和氢氧化钠，因为长时间的碱性条件会打断打断DNADNA，基因组，基因组DNADNA一旦发生断裂，只要是一旦发生断裂，只要是5050100kb100kb大小的片断就没有办法再被大小的片断就没有办法再被PDSPDS共沉淀了。共沉淀了。n由于还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚由于还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿氯仿/异戊醇进行抽提：异戊醇进行抽提：n1 1、酚：萃取蛋白、酚：萃取蛋白n2 2、氯仿：调节液体密度、氯仿：调节液体密度n3 3、异戊醇：消泡剂、异戊醇：消泡剂n。n回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2 2倍体积的乙醇。高浓度的盐会水合大量的水倍体积的乙醇。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此分子，因此DNADNA分子之间就容易形成氢键而发分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用7070的乙醇多洗几次。的乙醇多洗几次。操作注意事项操作注意事项n第一步：混匀要完全。第一步：混匀要完全。n第二步：时间不能过长，千万不要这时候去接第二步：时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNADNA片片断会慢慢断裂；必须温柔混合，不然基因组断会慢慢断裂；必须温柔混合，不然基因组DNADNA的断裂会导致抽提的质粒纯度大幅下降。的断裂会导致抽提的质粒纯度大幅下降。n第三步：冰上操作，严格按操作规程做。第三步：冰上操作，严格按操作规程做。n1.1.此法制备的高拷贝数质粒产量一般约为：每此法制备的高拷贝数质粒产量一般约为：每毫升原细菌培养物毫升原细菌培养物3 35g5g。n2.2.如果要通过限制酶切割反应来分析如果要通过限制酶切割反应来分析DNADNA，可，可取取1l DNA1l DNA溶液加到另一含溶液加到另一含8l8l水的微量离心水的微量离心管内，加管内，加1l 101l 10限制酶缓冲液和限制酶缓冲液和1 1单位所需单位所需限制酶，限制酶，37 37 温育温育1 12 2小时。将剩余的小时。将剩余的DNADNA贮存于贮存于2020。n3.3.此方法按比例放大可适用于此方法按比例放大可适用于100ml100ml细菌培养细菌培养物。物。细细菌基因菌基因组组DNADNA提取提取纯纯化化nCTAB/CTAB/NaClNaCl 法：法：细细菌基因菌基因组组DNADNA的制的制备备一、材料一、材料 细细菌培养物。菌培养物。二、二、试剂试剂 1 1、CTABCTAB十六十六烷烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵铵/NaClNaCl溶液：溶液：4.1g4.1gNaClNaCl溶溶解于解于 80ml80mlH H2 2O,O,缓缓慢加入慢加入10g10gCTAB,CTAB,加水至加水至100ml100ml。n 2 2、其它、其它试剂试剂：氯氯仿仿:异戊醇异戊醇(24:1)(24:1)，酚，酚:氯氯仿仿:异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)，异丙醇，异丙醇，70%70%乙醇，乙醇，TETE，10%10%SDSSDS，蛋白，蛋白酶酶K K(20mg/ml(20mg/ml或粉或粉剂剂)，5mol/L5mol/LNaClNaCl。n1 1、将菌株接种于将菌株接种于LBLB培养基，培养基，3737震荡培养过夜。震荡培养过夜。n2 2、取取1.5ml1.5ml培养物培养物12000r/min12000r/min离心离心2min2min。n3 3、弃上清，沉淀物中加入弃上清，沉淀物中加入567 567 L L的的TETE缓冲液，缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入反复吹打使之重新悬浮，加入3030 L L 10%SDS 10%SDS和和15ul15ul的蛋白酶的蛋白酶K K，混匀，于，混匀，于3737温育温育1h.1h.n4 4、加入加入100100 L L 5mol/L 5mol/L NaClNaCl,充分混匀，再加充分混匀，再加入入80ul CTAB/80ul CTAB/NaClNaCl溶液，混匀后于溶液，混匀后于6565温育温育10min10min。n5 5、加入等体积的酚加入等体积的酚/氯仿氯仿/异戊醇混匀，离心异戊醇混匀，离心4-5min,4-5min,将上清转入新将上清转入新EPEP管中，加入管中，加入0.6-0.80.6-0.8倍倍体积的异丙醇，轻轻混合直到体积的异丙醇，轻轻混合直到DNADNA沉淀下来，沉沉淀下来，沉淀可稍加离心。淀可稍加离心。n6 6、沉淀用沉淀用1ml1ml的的70%70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。乙醇洗涤后，离心弃乙醇。哺乳动物细胞哺乳动物细胞DNA的提取与纯化的提取与纯化n盐析法盐析法n原理：原理：细胞中的细胞中的DNADNA和和RNARNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白核蛋白及核糖及核糖核蛋白核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备混杂在一起。因此，要制备DNADNA首先要将这两种核蛋白分开首先要将这两种核蛋白分开。已知。已知这这两种核蛋白在不同两种核蛋白在不同浓浓度的度的盐盐溶液溶液中具有不同的溶解中具有不同的溶解度，如在度，如在0.15mol/L NaC1的稀的稀盐盐溶液溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则则最小（最小（仅约为仅约为在在纯纯水中水中的的1%）；而在）；而在l mol/L NaCl的的浓盐浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯纯水中的水中的2倍，核糖核蛋白的溶解倍，核糖核蛋白的溶解度度则则明明显显降低。根据降低。根据这这种特性，种特性，调调整整盐浓盐浓度即可把度即可把这这两种核蛋白分开。因此，在两种核蛋白分开。因此，在细细胞破碎后，用稀胞破碎后，用稀盐盐溶液，反复清洗，溶液，反复清洗，所得沉淀即所得沉淀即为为脱氧核糖核蛋白成分。脱氧核糖核蛋白成分。n分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠（SDS）使蛋白）使蛋白质质成分成分变变性，使性，使DNA游离出来，再用游离出来，再用含有异戊醇的含有异戊醇的氯氯仿沉淀除去仿沉淀除去变变性蛋白性蛋白质质。最后根据。最后根据DNA只溶于水而不溶于有机溶只溶于水而不溶于有机溶剂剂的特点，加入的特点，加入95%的的乙醇即可从溶液中把乙醇即可从溶液中把DNA沉淀出来，沉淀出来，获获得得产产品。品。n细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶核酸酶（DNaseDNase）立即开）立即开始降解始降解DNADNA，如不及时采取抑制措施，最后将会得不到任，如不及时采取抑制措施，最后将会得不到任何何DNADNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTAEDTA等螯合等螯合剂以除剂以除DNaseDNase必需的必需的MgMg2 2离子，使离子，使DNaseDNase活性降低，并要求活性降低，并要求整个操作均在整个操作均在44以下进行，最后加入以下进行，最后加入SDSSDS使所有的蛋白质使所有的蛋白质（包括（包括DNaseDNase）变性。如果希望获得更大分子的）变性。如果希望获得更大分子的DNADNA，则在，则在细胞破碎后，及时加入细胞破碎后，及时加入SDSSDS使蛋白质（包括使蛋白质（包括DNaseDNase）变性，）变性，并加入并加入蛋白酶蛋白酶K K，降解所有的蛋白质成为碎片或，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸氨基酸，及时阻止及时阻止DNaseDNase的降解作用。的降解作用。nDNADNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNADNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNADNA分子具有刚性，即分子是僵直的（分子具有刚性，即分子是僵直的（stiffstiff），），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNADNA断裂断裂成碎片。为保证获得大分子成碎片。为保证获得大分子DNADNA，操作时应避，操作时应避免剧烈振摇，或过大的离心力。转移吸取免剧烈振摇，或过大的离心力。转移吸取DNADNA时不可用过细的时不可用过细的吸头吸头，不可猛吸猛吹，更不能，不可猛吸猛吹，更不能用细的用细的吸头吸头反复吹吸。反复吹吸。n试剂及器材试剂及器材n（1）0.15mol/LNaCl0.015mol/LpH7.0柠檬酸钠溶液：柠檬酸钠溶液：称取称取8.77gNaCl，4.41g柠檬酸三钠（柠檬酸三钠（Na3C6H5072H20），），用约用约800ml蒸馏蒸馏水溶解，调节水溶解，调节pH至至7.0，最后定容至，最后定容至1000ml。n（2）0.15mol/LNaCl0.1mol/LEDTANa2溶液：称取溶液：称取8.77gNaCl，37.2gEDTANa2溶于约溶于约800ml蒸馏蒸馏水中，以水中，以NaOH调调pH至至8.0，最后定容至，最后定容至1000ml。n（3）5%（W/V）十二烷基硫酸钠（）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取）溶液：称取5gSDS溶于溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。的乙醇中。n（4）氯仿氯仿异戊醇溶液：按氯仿异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇异戊醇=24:1配制。配制。n5）pH8.0TE缓冲液或缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/LTrisHCl，lmol/LEDTANa2。或取。或取NaOH0.4g加蒸馏水至加蒸馏水至1000ml。n（6）95（V/V）乙醇）乙醇1000ml。n（7）75（V/V）乙醇）乙醇1000ml。n（8）组织捣碎机。组织捣碎机。n（9）玻璃匀浆器。玻璃匀浆器。n（10）冷冻冷冻离心离心机。机。n（11）冰、粗盐。冰、粗盐。n实验步骤实验步骤n（1 1）本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可）。本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可）。实验前将兔饥饿实验前将兔饥饿24h24h以上，以避免糖原的干扰。以上，以避免糖原的干扰。n（2 2）用用烧烧杯（杯（500ml500ml）装）装1/31/3体积的冰，加入少量水及约体积的冰，加入少量水及约20g20g食盐，制成食盐，制成冰盐水。冰盐水。n（3 3）将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约脏，称取约10g10g浸入在冰盐水预冷的浸入在冰盐水预冷的0.15mol/L 0.15mol/L NaClNaCl0.015mol/L0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物，再用少量溶液除去脂肪、血块等杂物，再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止反复洗涤几次，直至组织块无血为止。n（4 4）将洗净的组织剪成碎块。先加入将洗净的组织剪成碎块。先加入20ml 0.15mol/L 20ml 0.15mol/L NaClNaCl0.015mol/L0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2 23 3次，使细胞次，使细胞充分破碎。最后加入充分破碎。最后加入0.15mol/L 0.15mol/L NaClNaCl0.015mol0.015molL L柠檬酸钠柠檬酸钠溶液至溶液至50ml50ml。n（5 5）匀浆液于匀浆液于4 6 000r4 6 000rminmin离心离心15min15min，弃上清。在沉淀中加入，弃上清。在沉淀中加入4 4倍体积冷的倍体积冷的0.15mol/L 0.15mol/L NaClNaCl0.015 mol/L0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作条件，离心弃上清。如此重复操作2 23 3次。最后弃去上清，留沉淀。次。最后弃去上清，留沉淀。n（6 6）将沉淀物（约将沉淀物（约5m15m1）悬浮于）悬浮于5 5倍体积的倍体积的pH8.0pH8.0，0.015 mol/L 0.015 mol/L NaClNaCl0.1 mol/L0.1 mol/LEDTANaEDTANa2 2溶液中，搅匀，然后边搅拌边慢慢滴溶液中，搅匀，然后边搅拌边慢慢滴加加5%SDS5%SDS溶液，直至溶液，直至SDSSDS的最终浓度达的最终浓度达1%1%为止（应加多少毫升为止（应加多少毫升?）。）。（此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做。）然后，加入固体（此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做。）然后，加入固体NaClNaCl使最终浓度达使最终浓度达1mol/L1mol/L。继续搅拌。继续搅拌303045min45min，以确保，以确保NaClNaCl全部溶全部溶解，此时可见溶液粘稠度下降。解，此时可见溶液粘稠度下降。n（7 7）将上述混合溶液倒于一个将上述混合溶液倒于一个300ml300ml的带塞三角瓶中，加入等的带塞三角瓶中，加入等体积的氯仿体积的氯仿 异戊醇，振荡异戊醇，振荡10min10min。室温。室温3 000r/min3 000r/min离心离心10min10min（为什么可以在室温操作（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为），此时可见离心液分为3 3层：层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿 异戊醇。小异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中加入等体心吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中加入等体积氯仿积氯仿 异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提2 23 3次，除净蛋白质。次，除净蛋白质。n（8 8）最后最后1 1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），记录体积，放入干燥小次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），记录体积，放入干燥小烧烧杯杯中，加入中，加入2 2倍体积预冷的倍体积预冷的95%95%乙醇。边加边用玻璃棒慢慢搅拌，随着乙醇的不断加入可见溶液乙醇。边加边用玻璃棒慢慢搅拌，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，将黏稠丝状物尽可能多的缠在玻璃棒上。黏稠丝状物即是出现黏稠状物质，将黏稠丝状物尽可能多的缠在玻璃棒上。黏稠丝状物即是DNADNA。n（9 9）将所得的将所得的DNADNA从玻璃棒上取下，用从玻璃棒上取下，用75%75%乙醇洗乙醇洗2 2次，置于干次，置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。燥器中抽干，称取重量，计算产率。n（1010）按按200g/ml200g/ml的浓度称取一定量的浓度称取一定量DNADNA，溶于，溶于0.01 mol/L 0.01 mol/L NaOHNaOH溶液或溶液或pH8.0 TEpH8.0 TE缓冲液中（干燥缓冲液中（干燥DNADNA不易溶解，应在测定前不易溶解，应在测定前几天预先溶解）。几天预先溶解）。有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法n1 1、切取、切取组织组织5g5g左右左右,剔除剔除结缔组织结缔组织,吸水吸水纸纸吸干血液吸干血液,剪碎放剪碎放入研入研钵钵(越越细细越好越好)。2 2、倒入液氮、倒入液氮,磨成粉末磨成粉末,加加10ml10ml分离分离缓缓冲液。冲液。3 3、加、加1ml1ml10%10%SDS,SDS,混匀混匀,此此时样时样品品变变得很粘稠。得很粘稠。4 4、加、加50ul50ul或或 1mg1mg蛋白蛋白酶酶K,K,3737保温保温1-2h,1-2h,直至直至组织组织完全溶解。完全溶解。5 5、加、加1ml1ml5mol/L5mol/LNaClNaCl,混匀混匀,5000rpm,5000rpm离心数秒离心数秒钟钟。6 6、取上清液于新、取上清液于新EPEP管中，用等体管中，用等体积积酚酚:氯氯仿仿:异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)抽提。待分抽提。待分层层后后,3000rpm,3000rpm离心离心5 5分分钟钟。7 7、取上、取上层层水相至另一新水相至另一新EPEP管管,加加2 2倍体倍体积积乙乙醚醚抽提抽提(在通在通风风橱中橱中)。8 8、移去上、移去上层层乙乙醚醚,保留下保留下层层水相。水相。9 9、加、加1/101/10体体积积3mol/L3mol/LNaAcNaAc,及及2 2倍体倍体积积无水乙醇无水乙醇颠颠倒倒混合沉淀混合沉淀DNADNA。室温下静置。室温下静置10-2010-20分分钟钟，DNADNA沉淀形成白色絮沉淀形成白色絮状物。状物。1010、用玻璃棒、用玻璃棒钩钩出出DNADNA沉淀沉淀,70%,70%乙醇中漂洗后乙醇中漂洗后,在吸水在吸水纸纸上吸上吸干干,溶解于溶解于1ml1mlTETE中中,-20,-20保存。保存。1111、如果、如果DNADNA溶液中有不溶解溶液中有不溶解颗颗粒粒,可在可在5000rpm5000rpm短短暂暂离心离心,取取上清上清;如要除去其中的如要除去其中的RNA,RNA,可加可加5 5 L LRNaseA(10g/RNaseA(10g/L L),),3737保温保温3030分分钟钟,用酚抽用酚抽提后提后,按步按步骤骤9-109-10重沉淀重沉淀DNADNA。SDSSDS法法n实验原理实验原理：DNA主要存在于细胞核中。通过研主要存在于细胞核中。通过研磨和磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；白质；RNase降解降解RNA，从而得到纯净的，从而得到纯净的DNA分子。分子。试剂配制试剂配制n1 1、TrisTris HCL 1mol/L PH8.0 50ml HCL 1mol/L PH8.0 50ml40ml ddH40ml ddH2 2O O，6.057g6.057g固体固体TrisTris放入放入烧杯烧杯中溶解，用浓盐酸调中溶解，用浓盐酸调PHPH值值到到 8.08.0，ddHddH2 2O O 定容至定容至50ml50ml，高压灭菌后，降至室温，高压灭菌后，降至室温，44保存保存备用。备用。2 2、生理盐水、生理盐水:0.85%NaCL 100ml:0.85%NaCL 100ml在在20ml ddH20ml ddH2 2O O中溶解中溶解0.85g0.85g固体固体NaCLNaCL，定容至，定容至100ml100ml，摇匀后，贴，摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，上标签，高压灭菌后，降至室温，44保存备用。保存备用。3 3、EDTA 0.5mol/L PH8.0 50mlEDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml将将 9.08g9.08g的的EDTAEDTANa2Na22H2O2H2O溶解于溶解于40ml ddH40ml ddH2 2O O，用，用1g1g的的NaOHNaOH颗颗粒（慢慢加入）调粒（慢慢加入）调PHPH值到值到8.08.0，定容至，定容至50ml 50ml，如果，如果 EDTAEDTA难溶，难溶，先加先加NaOHNaOH溶解，然后逐步加溶解，然后逐步加EDTAEDTANa2Na22H2H2 2O O。4 4、TESTES缓冲液（释放缓冲液（释放DNADNA）100ml100ml将将 0.5844g0.5844g的的5 mol/5 mol/lNaCllNaCl溶解于溶解于80ml ddH80ml ddH2 2O O，在分别加入，在分别加入1ml1ml的的0.5 mol/l EDTA0.5 mol/l EDTA、0.2ml0.2ml的的Tris-HClTris-HCl(pH=8.0)(pH=8.0)，加定容至，加定容至100ml,100ml,摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，44保存备用。保存备用。n5 5、10%SDS10%SDS（变性剂（变性剂 破细胞壁）破细胞壁）100ml100ml 将将10g10g的十二烷基硫酸钠（的十二烷基硫酸钠（SDSSDS）溶解于）溶解于80ml ddH80ml ddH2 2O O中，于中，于6868加热溶解，用浓加热溶解，用浓HClHCl 调至调至PH=7.2PH=7.2，定容至，定容至100ml100ml，摇匀后，贴上标签，摇匀后，贴上标签，44保存备用。保存备用。6 6、蛋白蛋白酶酶K K（降解蛋白质）：（降解蛋白质）：20mg/mL 20mg/mL 无菌三蒸水溶解。无菌三蒸水溶解。7 7、RNARNA酶酶 （降解（降解RNARNA）：将胰）：将胰RNARNA酶（酶（RNARNA酶酶A A）溶于）溶于10mmol/L10mmol/L的的 TrisTrisCLCL（PH7.5PH7.5）、）、15mmol/LNaCL15mmol/LNaCL中，配成中，配成10mg/ml10mg/ml的浓度，于的浓度，于100100加热加热15min15min，缓慢冷却至室温，分装，缓慢冷却至室温，分装成小份存于成小份存于 2020。8 8氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇=24=24：1 100ml1 100ml按按24:124:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，44保存备保存备用。用。9 9TETE缓冲液（溶解缓冲液（溶解DNADNA）PH8.0 50mlPH8.0 50ml将将0.5ml 0.5ml 的的10mmol Tris-HCl(PH8.0)10mmol Tris-HCl(PH8.0)、0.1ml0.1ml的的0.5mol/l EDTA(PH8.0)0.5mol/l EDTA(PH8.0)加入到加入到50ml50ml的容量瓶中，调的容量瓶中，调PH8.0PH8.0定容至定容至50ml50ml摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，44保保存备用。存备用。实验步骤实验步骤n1组织块组织块解解冻冻，用生理，用生理盐盐水洗去血水洗去血污污，剪取，剪取约约0.5g组织组织，放入，放入 1.5mlEP管中，剪碎。管中，剪碎。