第十章维生素测定优秀课件.ppt

第十章第十章维生素生素测定定第1页，本讲稿共49页第2页，本讲稿共49页一、概述一、概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。第3页，本讲稿共49页维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。第4页，本讲稿共49页 我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。维生素分类：脂溶性（A、D、E、K）水溶性（B族、C）第5页，本讲稿共49页第6页，本讲稿共49页二、脂溶性V的测定 VA、VD、VE、VK与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。脂溶性维生素具有以下理化性质：1.溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2.耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。第7页，本讲稿共49页耐热性、耐氧化性 耐热性耐热性 氧化性氧化性V VA A 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 易被氧化（光、热促进其氧化）易被氧化（光、热促进其氧化）V VD D 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 不易被氧化不易被氧化V VE E 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促进其氧化）（光、热、碱促进其氧化）V VK K 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 易被光、氧化剂及醇破坏易被光、氧化剂及醇破坏第8页，本讲稿共49页根据上述性质。测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品 水洗去除类脂物 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩 测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。第9页，本讲稿共49页 维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。(一)维生素A的测定第10页，本讲稿共49页-H 维生素A醇-COCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯R:两两个个异异戊戊二二烯烯结结构构第11页，本讲稿共49页第12页，本讲稿共49页比色法测定VA的含量（GB/T 5009.822003中第二法）（一）原理 在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。第13页，本讲稿共49页适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于 5-10 g g)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰不易比色测定：该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在6秒钟秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。第14页，本讲稿共49页注意：1.维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。2.三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。第15页，本讲稿共49页(二)-胡萝卜素的测定 第一方法HPLC；第二方法为纸层析法（GB/T 5009.832003）。胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中以-胡萝卜素效价最高。第16页，本讲稿共49页 胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。-胡萝卜素的结构如下：第17页，本讲稿共49页 胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长处有最大吸收，只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取-胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。第18页，本讲稿共49页(三三)维生素维生素D的测定的测定 维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l 0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D 3及其维生素D原。维生素D 2无天然存在，维生素D3只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7-脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。维生素D2 药片吃多了中毒。第19页，本讲稿共49页维生素维生素D的结构的结构第20页，本讲稿共49页 分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法，是AOAC选定的正式方法。(一)三氯化锑比色法 (二)液相色谱法 它的的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。第21页，本讲稿共49页 三氯化锑比色法三氯化锑比色法原理原理v 在三氯甲烷溶液中，维生素在三氯甲烷溶液中，维生素D D与三氯化锑结与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D D含含量呈正比。量呈正比。v食品中维生素食品中维生素D D含量较低，其他维生素严含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化铝铝v此法测定的是维生素此法测定的是维生素D D2 2和维生素和维生素D D3 3的总量的总量洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱第22页，本讲稿共49页三、水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从肌体中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。第23页，本讲稿共49页 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。第24页，本讲稿共49页（一）维生素Bl的测定 维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。分析方法：GB/T 5009.842003中唯一的方法是荧光计法。第25页，本讲稿共49页v原理v 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（吡哆色素），在紫外线下，硫色素发出蓝色荧光。在给定的条件下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫色素含量成正比。v荧光测定条件：v 激发波长 365nm；狭缝 5nm.v 发射波长 435nm；狭缝 5nm.第26页，本讲稿共49页（二）维生素B 2的测定 维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。分析方法：GB/T 5009.852003中第一法为荧光法。第二法为微生物法。第27页，本讲稿共49页v原理v 核黄素在440-500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(连二亚硫酸钠 Na2S2O4),将核黄素还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。v测定v 于激发波长440nm，发射波长525nm，测量样品管及标准管的荧光值。第28页，本讲稿共49页维生素B 6的测定v原理v微生物的生长与它们对某些特定的维生素的需求有关，因此在维生素分析中，将某些微生物在含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中该维生素的含量。生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，测定浊度是最常用的方法。维生素B 6的含量在2ng/mL以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，可以定量测定。第29页，本讲稿共49页v测定测定v在在550nm550nm波长下测定吸光度值。绘制波长下测定吸光度值。绘制维生素B 6标准曲线，计算标准曲线，计算第30页，本讲稿共49页（三）维生素C的测定 维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。第31页，本讲稿共49页vVC检测技术v2,6二氯靛酚滴定法 简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）v二甲苯二氯靛酚比色法 深色v荧光法：准确度高，较复杂v2，4-二硝基苯肼法还原还原型型VCVC的测的测定定总总VCVC的测定的测定总总VC=VC=氧化型氧化型VC+VC+还原型还原型VC+VC+二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸少少氧化氧化+还原还原+二酮古乐糖二酮古乐糖酸酸操作复杂，结果易受影响操作复杂，结果易受影响氧化型氧化型+还原型还原型第32页，本讲稿共49页(1)2,6-(1)2,6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 1原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。第33页，本讲稿共49页2 2、试剂、试剂 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000mL；2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000mL；维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100mL，吸5mL于50mL容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250mL，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。第34页，本讲稿共49页标定一标定一吸标液（VC）5mL于三角瓶加6%KI溶液0.5mL加1%淀粉3滴用0.001mol KIO3标液滴定到淡兰色。计算：抗坏血酸浓度（mg/mL）=（V10.088）/V2V1-滴定时消耗0.001mol KIO3标液的体积（mL）V2-维生素C重量（g）0.088-1mL 0.001mol KIO3标液维生素C的量（mg/mL）第35页，本讲稿共49页标定二标定二吸5mL已知浓度VC标液 加5mL1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）T=（C V1）/V2C-维生素C的浓度（mg/mL）V1-维生素C的体积（mL）V2-消耗2，6-二氯靛酚的体积（mL）第36页，本讲稿共49页样品测定样品测定提取：称样50g加2%草酸100mL入捣碎机中处理过滤颜色若深可加白陶土滴定：吸5mL样液于三角瓶用染料滴定至粉红色15秒内不褪色计算：VC（mg/100g）=（V T）/W 100 V-消耗染料体积（mL）T-1mL染料所能氧化维生素C的毫克数W-滴定时所有滤液中含有样品的克数第37页，本讲稿共49页4 4、注意事项、注意事项 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；样品进入实验室后，应浸泡在2%草酸液中（已知量），以防氧化，损失维生素C；贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低价铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数值增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；第38页，本讲稿共49页 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。第39页，本讲稿共49页(二二)2)2，44二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法 可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC。第40页，本讲稿共49页v试剂1.4.5mol/L硫酸：小心将250mL硫酸(比重1.84)加入到700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。2.85%硫酸：小心将90mL硫酸(比重1.84)加入到100mL水中，搅拌均匀。3.2%2，4二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。4.2%草酸溶液：溶解20g草酸(H2C2O4)于700mL水中，再加水稀释至1000mL。5.1%草酸溶液：稀释500mL2%草酸溶液到1000mL。第41页，本讲稿共49页v6.1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。7.2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。8.1mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。9.抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL1%草酸中。10.活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110烘箱中烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。第42页，本讲稿共49页(一一)样品的制备样品的制备v1.浸提：鲜样的制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取1040g匀浆(含12mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。干样制备：称14g干样(含12mg抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。第43页，本讲稿共49页v2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）v2 2、氧化、氧化v取取25ml 25ml 样品滤液样品滤液2g2g活性活性C C 振摇振摇1min 1min 过滤过滤v取滤液取滤液10ml 10ml2%10ml 10ml2%硫脲溶液硫脲溶液样品氧化液样品氧化液v3 3、呈色反应、呈色反应最初滤液舍去最初滤液舍去4ml4ml氧化液氧化液4ml4ml氧化液氧化液4ml4ml氧化液氧化液空白空白平行实平行实验验2 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼373h373h防止防止VCVC继续被氧化继续被氧化促进脎的形成促进脎的形成氧化剂氧化剂+脱色剂脱色剂第44页，本讲稿共49页冷却冷却空白液空白液室温室温样品液样品液冰水冰水冰水冷却冰水冷却2 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼10-15min10-15min后后 4 4、85%85%硫酸处理硫酸处理本步已成脎，但显色不稳定本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为用浓硫酸处理，转变为橘红色的双橘红色的双-2-2，4-4-二硝基苯二硝基苯每支每支+5ml 85%+5ml 85%硫酸硫酸 边加边摇边加边摇至少加至少加1min1min室温下室温下放置放置30min 30min 第45页，本讲稿共49页 5 5、比色测定、比色测定 测测A A500500 6 6、绘制标准曲线、绘制标准曲线 50ml1mg/ml50ml1mg/ml抗坏血酸标准溶液抗坏血酸标准溶液1g1g活性活性C C 振摇振摇1min 1min 过滤过滤取滤液取滤液10ml 5g10ml 5g硫脲硫脲 1%1%草酸定容到草酸定容到500ml 500ml（浓度为（浓度为20g/ml 20g/ml）1%1%硫脲稀释到不同浓度（硫脲稀释到不同浓度（1/2/4/6/10/12g/ml1/2/4/6/10/12g/ml）以下操作同样品测定以下操作同样品测定取取4ml 24ml 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼 373h 5ml 85%373h 5ml 85%硫酸硫酸室温下放置室温下放置30min 30min A500 A500 标准曲线标准曲线第46页，本讲稿共49页7 7、注意事项、注意事项 硫脲可以保护抗坏血酸不被氧化，并且能帮助脎的形硫脲可以保护抗坏血酸不被氧化，并且能帮助脎的形成。最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。成。最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。试管从冰中取出后，样品中糖类的存在会造成颜试管从冰中取出后，样品中糖类的存在会造成颜色逐渐加深，因此色逐渐加深，因此3030分钟后准时比色。分钟后准时比色。试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后入硫酸后3030分钟应准时比色。分钟应准时比色。活性活性CC氧化剂氧化剂+脱色剂（深色样品）脱色剂（深色样品）无色或已脱色样品无色或已脱色样品溴或溴或2 2，6 6二氯靛酚作氧化剂二氯靛酚作氧化剂第47页，本讲稿共49页(3)荧光法GB/T 5009.86-2003 第一法第48页，本讲稿共49页第49页，本讲稿共49页