细菌基因组DNA提取实验.pdf

细菌基因组 DNA 提取实验标签：细菌 基因组 DNA 提取细菌基因组 DNA 提取可以：（1）获得细菌基因组 DNA；（2）作为 PCR 模板；（3）用于测序、遗传信息分析等。实验方法实验方法细菌基因组 DNA 试剂盒提取法实验方法原实验方法原理理实验材料实验材料试剂、试剂试剂、试剂盒盒仪器、耗材仪器、耗材实验步骤实验步骤本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术，结合 DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。适合于从1.0109细菌中获得多至20 g 的基因组 DNA。用于 PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。细菌培养物细菌基因组 DNA 试剂盒DNA 制备管小量滤器离心管一、试剂盒组成、贮存、稳定性一、试剂盒组成、贮存、稳定性1.说明书，耗材：DNA 制备管，小量滤器，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。2.RNase A：50 mg/ml，室温保存。3.溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml，-20密闭贮存。4.Buffer S：细菌原生质制备液，加入RNase A 后，4密闭贮存。5.0.25M EDTA：室温密闭贮存。6.Buffer G-A：裂解液，室温密闭贮存。7.Buffer G-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。8.Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。9.Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。10.Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。11.Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。12.Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。13.Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。二、实验准备二、实验准备1.第一次使用时，在 Buffer W2 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。2.准备 Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶中，混合均匀。3.4预冷 Buffer DV。4.第一次使用试剂盒时，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml。5.第一次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNase A 全部加入 Buffer S 中，混合均匀。6.准备65水浴。7.检查 Buffer G-A 和 Buffer G-B 是否出现沉淀，若出现沉淀，于 65水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。8.将 Eluent 或去离子水加热至65有利于基因组 DNA 的充分洗脱。三、操作步骤三、操作步骤1.用2 ml 离心管收集1.0109（1 ml 菌液 OD600 为1-1.5）的细菌培养物，12000g 离心30 s，弃尽上清。用150 l 已加入 RNase A 的 Buffer S 悬浮沉淀。*确认 RNase A 已加入 Buffer S 中。*悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则将影响溶菌效果。2.加入20 l 溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5 min。3.加入30 l 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5 min。4.加入450 l Buffer G-A,旋涡振荡15 s，65水浴10 min。5.加入400 l Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4预冷），用力混合，12 000g 离心2 min。*请在实验前按照实验准备步骤2 内容，准备 Buffer DV。6.尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1 ml 4预冷 Buffer DV，用力混合，12 000g 离心2 min。7.丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于 2 ml 离心管中）。12 000g 离心1min。*上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在 Tip 头内迅速分相，便于丢弃。*如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可过滤除去。*有色上相务必除尽，否则将抑制DNA 结合到 silica 膜上。8.弃滤器，在滤液中加入400 l Buffer BV，混合均匀。步骤9-12 可选择离心法或负压法A.负压法9A.将制备管插到负压装置的插口上，将步骤8 中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，吸尽管中溶液。10A.保持负压，加入500 l Buffer W1，吸尽管中溶液。11A.保持负压，沿管壁四周加入700 l Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 l BufferW2 洗涤一次。*确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。*沿管壁四周加入 Buffer W2 有助于彻底冲洗沾附在管壁上的盐份。*两次用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。12A.将制备管置于一个2 ml 离心管中，12 000g 离心1 min。B.离心法9B.将制备管置于 2 ml 离心管中，将步骤 8 中的混合液移入制备管中，12,000g 离心1 min。10B.弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入500 l Buffer W1，12000g 离心1 min。11B.弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入700 l Buffer W2，12000g 离心1 min。以同样的方法再用700 l Buffer W2 洗涤一次。注意事项注意事项*确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。*两次用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。12B弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，12 000g 离心1 min。13.将制备管置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在 silica 膜中央加100-200 lEluent 或去离子水，室温静置1 min。12 000g 离心1 min 洗脱 DNA。*将去离子水或 Eluent 加热至65将提高洗脱效率。收起1.Buffer G-B、Buffer BV 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。