3.2基因工程的基本操作程序课件高二生物人教版选择性必修三.pptx

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程1.基因工程的基本操作程序主基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些的技术和方法有哪些？转基因抗虫棉也称为转Bt基因抗虫棉。它是将苏云金芽孢杆菌的Bt基因导入到受体细胞(转基因抗虫棉的叶肉细胞)中。苏云金芽孢杆菌的代谢过程中能产生一种Bt杀虫蛋白，它对多种害虫具有毒杀作用，作为生物农药广泛使用在蔬菜、瓜果等作物上。通过根癌农杆菌介导等方法将Bt基因转入棉花植株的细胞中后，棉株体内也能合成Bt杀虫蛋白。转Bt基因抗虫棉的杀虫谱因Bt基因不同而存在差异。我国现有的转基因抗虫棉对棉铃虫、红铃虫、卷叶虫等鳞翅目的害虫具有非常显著的抗性。1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？（1）转基因抗虫棉抗虫的机制是抗虫基因（Bt基因）来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因表达产生的蛋白质，这种蛋白质在害虫肠道内被激活，造成肠道穿孔，导致害虫死亡。（2）培育转基因抗虫棉的步骤有目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程的基本操作程序（四个步骤）目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定前提保证关键核心有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达一、目的基因的筛选与获取1.目的基因的概念：（1）改变受体细胞性状：如抗虫性状（2）获得预期表达产物：如胰岛素2.目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌）、人胰岛素基因、人干扰素基因等3.转基因抗虫棉抗虫的机制：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。4：获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取基因组文库cDNA文库（2）人工合成化学合成法逆转录法现在常用PCR技术获取和扩增PCR技术的原理：利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。PCR技术中引物的作用：引物的优劣直接关系到PCR的成功与否。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，可以是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点，分别与DNA分子两条模板链的3端结合。PCR扩增后得到的产物同样可以和引物结合。PCR扩增的过程：三步一循环，即高温变性、低温复性、适温延伸，一般设置3035个循环。二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的：这是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用2.基因表达载体的组成（1）目的基因：外源DNA分子中具有遗传效应的片段（2）启动子位置：基因的首端功能：是R聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA（3）终止子位置：基因的尾端功能：终止转录（4）标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因4.过程：一般用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接成重组DNA 基因表达载体构建模型思考：思考：构建基因表达载体时应考虑哪些因素？1.启动子的选择要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果想让基因只在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择在种子中特异性表达的启动子。2.特殊基因的添加有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.天然质粒不可直接作为运载体自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，不能直接作为运载体。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。4.限制酶的选择基因表达载体的构建过程中，最好用同种限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端（或平末端），便于二者进行连接。但有时用两种限制酶切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接及目的基因与载体之间的反向连接。三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入受体细胞的方法：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。由于受体细胞的种类不同，选用的转化方法也要根据具体情况而定。将目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞：显微注射法（受精卵）。将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法（感受态细胞）。2.受体细胞的选择：对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。农杆菌转化法：首先将目的基因插入农杆菌的Ti质粒的T-DNA上，构建基因表达载体；然后将基因表达载体转入农杆菌（常用Ca2+处理成感受态细胞）。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引含重组Ti质粒的农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中已经插入了目的基因的T-DNA,就可以进入植物细胞，并将目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。由受体细胞培育成植株需要用到植物组织培养技术。农杆菌转化法示意图四、目的基因的检测与鉴定对目的基因的检测与鉴定分为分子水平和个体生物学水平两个层次。1.分子水平的检测检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上：DNA分子杂交技术。检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原抗体杂交技术。2.个体生物学水平的鉴定进行害虫或病原体的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。检测转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。目的基因是否插入mRNA蛋白质个体转录翻译检测检测DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗虫或抗病接种实验现象现象现象现象是否出现杂交带是否出现杂交带是否出现杂交带是否抗虫或抗病鉴定分子水平检测个体水平检测思考：思考：基因表达载体中已经具备标记基因，对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？基因表达载体中的标记基因（如抗生素抗性基因）可以对受体细胞进行初次筛选：利用含抗生素的选择培养基培养细胞，在这种培养基上能生长的是具有抗生素抗性的细胞，即导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，虽然在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插人的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译及个体水平上进行检测和鉴定。1.如图为某一重组质粒示意图，下列叙述错误的是()A.用限制酶EcoR处理该质粒得到的分子共含有4个游离的磷酸基团B.同时用限制酶EcoR和BamH处理该质粒可得到3个双链DNA片段C.在获得目的基因时应该使用的限制酶是BamHD.将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞C2.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，是成功的关键，下列相关说法不正确的是()A.构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代B.基因工程中使用的标记基因有许多种，有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是人为加上去的C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码和终止密码等结构D.基因表达载体中的复制原点是质粒DNA的复制的起点C3.基因和表达载体相连时既可以正向连接也可以反向连接。下图甲、乙分别表示某质粒、含目的基因和酶切位点的DNA片段，构建基因表达载体时应用酶B和酶C进行切割，不应用酶A切割运载体和DNA片段，其原因不包括()A.防止目的基因和运载体发生反向连接B.保证构建的重组质粒中含有标记基因C.防止目的基因或运载体重新自身环化D.保证构建的重组质粒中含有启动子D4.土壤农杆菌中含有Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，Ti质粒上的T-DNA片段可整合到植物细胞中的染色体DNA上。若想用基因工程手段获取抗旱植株，以下分析不合理的是()A.若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以先用钙离子处理农杆菌C.用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞后，可通过植物组织培养技术得到具有抗旱基因的植物D.若能在植物细胞中检测到抗旱基因，则说明该基因工程项目获得成功D